黄曲霉毒素B_1(Aflatoxin B_1,AFB_1)作为自然界中已知的最强致癌物,能严重影响畜禽的生产性能和健康。AFB_1在肝脏中会代谢成黄曲霉毒素M_1(Aflatoxin M_1,AFM_1),通过乳腺进入牛奶中引起食品安全问题,并可能与AFB_1共存,共同损伤乳腺健康。玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)是一种能紊乱激素稳态的真菌毒素,能改变动物对外源有害物质的敏感性。ZEN常常与AFB_1共同污染饲料,而妊娠期和泌乳期的哺乳动物处于内分泌的特殊时期,因此ZEN可能会影响AFB_1对妊娠期和泌乳期哺乳动物的毒性。本文通过细胞试验研究了AFB_1和AFM_1对奶牛乳腺细胞的影响及其机理;通过动物试验研究了AFB_1对妊娠期和泌乳期大鼠乳腺、卵巢、肝脏和脾脏的毒性,以及ZEN对其毒性的影响和机制。研究结果可为评估真菌毒素对妊娠期和泌乳期哺乳动物的影响以及相关饲料卫生措施的制定提供理论指导和科学依据。主要从以下三个方面开展研究:一、AFB_1和AFM_1对牛乳腺细胞的影响及其机理将牛乳腺上皮细胞分为6个组:对照组;2 mg/L AFB_1组;10 mg/L AFB_1组;2mg/L AFM_1组;10 mg/L AFM_1组;2 mg/L AFB_1+2 mg/L AFM_1组。各组细胞按相应的毒素水平处理24 h后,检测AFB_1和AFM_1对乳腺细胞的细胞存活率、细胞凋亡、细胞周期、线粒体膜电位、抗氧化能力、RNA m~6A甲基化Wnt-C59体内实验剂量水平的影响以及AFB_1转化成AFM_1的水平,并通过转录组学分析毒素对基因表达的影响。主要的试验结果如下:1.AFB_1和AFM_1降低了乳腺细胞的细胞存活率、处于分裂期的细胞比例和线粒体膜电位异常的细胞比例,提高了凋亡细胞的比例;AFB_1组比AFM_1组造成了更严重的细胞死亡、细胞凋亡和细胞周期阻滞。AFB_1组乳腺细胞的抗氧化能力明显降低。AFB_1经牛乳腺细胞培养处理后未检出AFM_1。结果表明,AFB_1和AFM_1对乳腺细胞均具有较强的细胞毒性,相同剂量时AFB_1的毒性强于AFM_1。该乳腺细胞不能将AFB_1转化成AFM_1。与单独的2 mg/L AFB_1或AFM_1组相比,2 mg/L AFB_1+2 mg/L AFM_1组造成了更严重的细胞死亡、细胞周期阻滞和细胞凋亡,说明AFB_1和AFM_1对乳腺细胞的毒性具有累加效应。2.转录组学的结果发现,AFB_1和AFM_1造成许多与细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期、细胞间紧密连接和氧化应激相关基因的表达发生变化,且降低了RNA m~6A甲基化的水平。表明AFB_1和AFM_1对乳腺细胞的基因表达造成广泛影响并存在剂量依赖效应,AFB_1和AFM_1可能是通过影响基因的表观遗传修饰来发挥其毒效应。AFB_1组引起的差异基因数量明显多于AFM_1组,表明AFB_1对乳腺细胞中基因表达的影响更大。与单独的2 mg/L AFB_1或AFM_1组相比,2 mg/L AFB_1+2 mg/L AFM_1组造成了更严重的细胞损伤和更多相关的基因表达发生改变,表明AFB_1和AFM_1对乳腺细胞基因表达的影响具有累加效应。二、AFB_1对大鼠乳腺和卵巢的毒性及ZEN对其毒性的影响和机制将40只受孕的Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为4个处理组,每组10只,每只单笼饲养。各组分别饲以不同处理的日粮:对照组(饲喂基础日粮)、AFB_1组(饲喂基础日粮+2 mg/kg AFB_1)、AFB_1+1 ZEN组(饲喂基础日粮+2 mg/kg AFB_1+1mg/kg ZEN)和AFB_1+10 ZEN组(饲喂基础日粮+2 mg/kg AFB_1+10 mg/kg ZEN)。试验时间为妊娠期和泌乳期,记录母鼠每周的平均体重、平均日增重和平均日采食量等生长性能以及产仔数、单次泌乳量和仔鼠体重等繁殖性能。在第35 d时采集母鼠的血清、乳腺和卵巢,进行血生化分析、RT-q PCR检测、代谢组学和转录组学的分析,探究AFB_1对大鼠乳腺和卵巢的毒性及ZEN对其毒性的影响和机制。主要的试验结果如下:1.与对照组相比,AFB_1组降低了母鼠在妊娠期和泌乳期的平均体重、平均日增重和平均日采食量(P<0.05),仔鼠的平均体重降低了24.3%,但窝产仔数平均增加了2.4只。AFB_1组的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、血中的尿素氮(BUN)和葡萄糖分别升高了38.3%、70.6%、78.5%、22.0%和17.9%(P<0.05);总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、胆固醇(CHOL)和甘油三酯(TG)分别降低了15.6%、13.3%、14.7%和9.0%(P<0.05)。与AFB_1组相比,采食量、仔鼠体重和血清生化指标在AFB_1+1 ZEN组中的变化有所缓解,但在AFB_1+10 ZEN组中的变化更为剧烈。结果表明,AFB_1降低了妊娠期和泌乳期大鼠的生长性能和繁殖性能,并改变了血生化指标;ZEN影响了AFB_1对大鼠生长性能、繁殖性能和血生化指标的危害,并表现为低剂量时部分拮抗AFB_1的危害,高剂量时增强AFB_1的危害。2.与对照组相比,AFB_1组改变了乳腺和卵巢的组织学形态,升高了细胞炎性因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)和8-羟基脱氧鸟苷(8-OHd G)在乳腺和卵巢中的水平,以及血清中三种乳腺癌标志物的水平(P<0.05)。AFB_1组中母鼠在第13 d的单次泌乳量降低了12.2%(P<0.05),血清、乳腺和卵巢中的E_2和PRL的水平也显著降低了(P<0.05)。在乳腺和卵巢中,AFB_1组影响了与ER应激(GRP78、ATF4、ATF6、CHOP)、热休克蛋白(Hsp27、Hsp70、Hsp90)、细胞凋亡(p38、p53、Bax、Bcl-2)、炎症反应(Nlrp3、IL-1β、IL-6、TNF-α)和性激素受体(Esr1和Prlr)相关基因的表达(P<0.05)。与AFB_1组相比,单次泌乳量、炎性因子、8-OHd G和相关基因表达在AFB_1+1 ZEN组中的变化有所缓解,但AFB_1+10 ZEN组中的变化更为剧烈。AFB_1+1 ZEN组和AFB_1+10 ZEN组都进一步升高了乳腺癌标志物水平,进一步降低了E_2和PRL的水平。结果表明,AFB_1损伤了乳腺和卵巢的组织形态,诱导ER应激和炎症反应,降低了性激素水平;ZEN影响了AFB_1对乳腺和卵巢中组织形态和相关基因表达的危害,并表现为低剂量时部分拮抗AFB_1的危害,高剂量时增强AFB_1的危害。ZEN可紊乱性激素水平并增加AFB_1致乳腺发生癌变的风险。3.乳腺代谢组中,AFB_1组主要影响了氨基酸代谢和糖代谢;AFB_1+1 ZEN组影响的代谢物种类最为丰富;AFB_1+10 ZEN组主要影响了脂质代谢;并通过ROC分析发现一些关于ZEN影响AFB_1毒性的标志代谢物。卵巢转录组中,AFB_1影响了卵巢中许多与固醇类、脂质代谢和炎症反应相关基因的表达,并通过网络图和表达倍数变化热图找到一些SFRP2、Msx1和Hoxd10等可能参与ZEN影响AFB_1毒性的关键节点基因和表达异常基因。与对照组相比,AFB_1组乳腺中RNA m~6A甲基化水平降低了37.5%,METTL3和METTL14的表达均显著下调,而FTO、ALKHB5和YTHDF1的表达均显著上调(P<0.05)。结果表明,AFB_1影响了乳腺中的代谢活动、卵巢中的基因表达和表观遗传修饰;ZEN可影响AFB_1对代谢物和表观遗传修饰的作用,并表现为低剂量时部分拮抗AFB_1的作用,高剂量时增强AFB_1的作用。ZEN可能是通过影响细胞代谢活动、RNA m~6A甲基化、关键节点基因和表达异常基因等途径,影响AFB_1对乳腺和卵巢的毒性。三、AFB_1对大鼠肝脏和脾脏的毒性及ZEN对其毒性的影响和机制试验设计与前面相同,大鼠为同一批动物。采集母鼠的肝脏、仔鼠的肝脏和母鼠的脾脏,进一步探究AFB_1对大鼠肝脏和脾脏的毒性及ZEN对其毒性的影响和机制。主要的试验结果如下:1.与对照组相比,AFB_1组降低了母鼠和仔鼠肝脏中的抗氧化能力,血清中细胞炎性因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)和8-OHd G的水平分别升高了1.6-3.5倍和8.8倍(P<0.05)。在肝脏和脾脏中,AFB_1组影响了与ER应激、热休克蛋白、细胞凋亡和炎症反应相关基因的表达(P<0.05),显著降低了母鼠肝脏中31.7%的RNA m~6A甲基化水平和下调METTL3和METTL14的表达,而显著上调Microtubule Associat抑制剂FTO、ALKHB5和YTHDF1的表达(P<0.05)。与AFB_1组相比,抗氧化能力、炎症因子和表观遗传修饰在AFB_1+1 ZEN组中的变化有所缓解,但在AFB_1+10 ZEN组中的变化更为剧烈。结果表明,AFB_1诱导肝脏和脾脏发生氧化应激和炎症反应,降低了肝脏中抗氧化能力和RNA m~6A甲基化水平;ZEN可影响AFB_1对肝脏和脾脏的毒性,并表现为低剂量时部分拮抗AFB_1的毒性,高剂量时增强AFB_1的毒性。2.与对照组相比,AFB_1组上调了母鼠肝脏中与Ⅰ相代谢相关基因(CYP1A2、CYP1B1、CYP2B1、CYP2E1)的表达,下调了与Ⅱ相解毒相关基因(GSMT1、CAT、Nrf2、Keap1)的表达(P<0.05)。而与AFB_1组相比,AFB_1+1 ZEN组CYP1B1、CYP2B1、GSMT1和Nrf2的表达显著下调;AFB_1+10 ZEN组显著上调了与Ⅰ相代谢相关的基因表达,显著下调了GSMT1和Nrf2(Ⅱ相解毒相关)的表达(P<0.05)。在AFB_1+1 ZEN组和AFB_1+10 ZEN组中,母鼠血清、仔鼠血清和母鼠乳腺中AFM_1的水平升高了16.9%-45.4%(P<0.05)。结果表明,AFB_1影响了母鼠肝脏中与Ⅰ相代谢和Ⅱ相解毒相关基因的表达;ZEN可能是通过影响肝脏中Ⅰ相代谢和Ⅱ相解毒相关基因的表达,来增强AFB_1向AFM_1的转化。综上所述,本研究得出以下结论:1.AFB_1和AFM_1均具有较强的细胞毒性并具有累加效应,AFB_1的细胞毒性强于AFM_1。AFB_1和AFM_1能诱导乳腺细胞发生细胞坏死、细胞凋亡、细胞周期阻滞和氧化应激;2.AFB_1和AFM_1对乳腺细胞毒性的作用机制可能是通过影响表观遗传修饰来调控下游基因的表达,最终产生细胞毒性;3.AFB_1能抑制妊娠期和泌乳期母鼠及其non-infectious uveitis后代的生长,造成乳腺、卵巢、肝脏和脾脏发生内质网应激、细胞凋亡和炎症反应等多种损伤。AFB_1还影响乳腺中的代谢活动与表观遗传修饰、卵巢中相关的基因表达,降低性激素水平;4.ZEN可影响AFB_1对大鼠乳腺、卵巢、肝脏和脾脏的毒性,并表现为双重效应,即高剂量时增强了AFB_1的毒性,而在低剂量时部分减弱了AFB_1造成的损伤。ZEN可紊乱性激素水平和增强AFB_1向AFM_1的代谢转化,增加AFB_1致乳腺发生癌变的风险,进一步紊乱性激素水平并增加乳腺发生癌变的风险。ZEN影响AFB_1毒性的机制可能是ZEN通过影响细胞代谢活动、RNA m~6A甲基化修饰、性激素水平、关键节点基因和表达异常基因的表达等多种途径来影响AFB_1的毒性。