海栖热袍菌(Thermotoga maritima)是一种严格厌氧的极端嗜热微生物,分离自海底沉积物中,最适生长温度80,通过发酵多种碳水化合物进行异养生长。T.maritima能够降解众多碳水化物产氢气,特别是具有降解纤维素、木聚糖等多糖的能力,并且有着极高的产氢效率,在生物氢能源开发中也具有很好的潜力。同时,T.maritima是一个研究极端嗜热细菌的模式微生物,它属于细菌中最为古老的一个进化分支,且基因组成与古菌有着很多相似之处,对它的研究有利于进一步理解嗜热微生物乃至地球早期微生物的生理代谢。早期的研究发现,T.maritima具有还原单质硫和硫代硫酸盐生成H2S的能力,并且硫还原代谢会对T.maritima生长产生明显影响。对于这类嗜热微生物硫还原代谢机制的研究,有利于加深对地热环境中硫循环的理解。围绕T.maritima硫还原代谢以及细胞内氧化还原平衡关键酶展开研究,主要研究内容如下:一、测定了 S0和Na2S2O3对T.maritima生长代谢的影响,发现T.maritima可能具有新的细菌硫还原代谢机制。生长实验发现S0和Na2S2O3能够对T.maritima的生长产生促进作用,同时发现Na2Sn对T.maritima的生长的促进比S0更为明显,说明多硫化物可能是T.maritima利用硫单质的直接形式。S0和Na2S2O3对.T.maritima生长的促进作用主要体现在T.maritima指数生长后期,在生长前期并没有明显影响。IACS-010759半抑制浓度结合T.maritima基因组中缺少硫呼吸相关基因,可以认为T.maritima还原S0和Na2S2O3并不是通过传统的硫呼吸链进行。H2会对生长产生抑制,推测这可能是由于高浓度H2抑制了的氢化酶产氢,进而导致NADH、Fdred等还原型电子载体的积累,间接影响了T.maritima的糖代谢。向培养基中加入S0或Na2S2O3可以减轻H2对生长的抑制作用,并且在更高浓度H2的抑制下,S0和Na2S2O3的促进作用也更明显。在没有H2抑制的情况下,S0和Na2S2O3对生长的促进作用很小,说明S0和Na2S2O3对T.maritima生长的主要影响是减轻H2对生长的抑制作用。对氢化酶基因hydA转录水平和氢化酶HydABC酶活性的研究发现,S0和Na2S2O3的还原会影响氢化酶基因的表达并最终对产氢量产生影响,同时产生大量H2S。对T.maritima细胞质和细胞膜组分中酶活的分析发现细胞膜中存在还原态铁氧还蛋白(Fdred)依赖的硫烷硫还原酶活性,基因组调查发现这可能是由十三亚基组成的膜结合的硫烷硫还原酶MBX的活性,转录分析mbx在S0存在时转录水平上调了 4倍左右,说明其的确参与到硫还原代谢中。另外还在T.maritima细胞质组分中检测到NADH依赖的单质硫还原酶活性和硫代硫酸盐还原酶活性,说明T.maritima可能存在新型的细菌硫还原酶和硫代硫酸盐还原酶。二、异源表达并纯化获得了 NAD(P)H依赖的多硫化物还原酶NSR,并且该酶还具有硫代硫酸盐还原酶活性,对其性质与功能进行了研究。基于细胞质组分中检测到的硫还原酶活性,对T maritima基因组进行调查,筛选可能的硫还原酶基因。通过异源表达和纯化获得TM0379编码的蛋白NSR,该酶是一个分子量约50 kDa的黄素蛋白,结合有一分子FAD。NSR具有NAD(P)H依赖的单质硫还原活性,比酶活约1.3 U/mg。NSR还具有多硫化物还原酶活性,比酶活约0.35 U/mg,说明多硫化物可能是其直接的电子受体。CoA能将NSR还原S0活性提高3倍,NSR对二硫化物的还原活性说明CoA的促进作用可能是由于CoA能够与S0反应生成CoA二硫化物或过硫化物,促进S0的溶解和与酶分子的结合。保守的Cys43半胱氨酸残基是NSR还原硫的一个关键催化位点,突变此残基会使NSR失去活性。T.maritima的NSR与其古菌同源蛋白在性质与功能上有很多相似之处,但也有着明显不同:T.maritima的NSR不具有NAD(P)H氧化酶活性,即不能利用O2做底物。最为明显的一个不同是,T.maritiam的NSR还具有硫代硫酸盐还原酶活性,比酶活约6.8 U/mg。氧化还原感应全局转录调控蛋白Rex对nsr基因转录具有调控作用,说明NSR对于T.maritima细胞内氧化还原平衡具有直接影响。转录水平研究表明,nsr基因在S0和Na2S2O3环境中转录水平分别上调了 5-6倍,说明NSR可能同时参与到T.maritima的单质硫和硫代硫酸盐两种硫还原代谢中。Fd:NAD+氧化酶rnf基因在Na2S2O3环境中转录水平上调了 10倍以上,多余的Fdred可以通过细胞膜上的Rnf蛋白将电子传递给NAD+产生NADH,用于硫代硫酸盐的还原。yeeE基因在Na2S2O3环境中转录水平上调约40倍,其编码蛋白可能参与到硫代硫酸盐的转运过程中。三、对T.maritima TM0754基因编码的NADH氧化酶Nox和电子歧化转氢酶NfnAB进行了异源表达,结合酶活与转录实验对其性质功能进行研究,并对NfnAB进行了关键氨基酸残基定点突变,对关键氨基酸位点的功能进行了分析。对TM0395进行异源表达和纯化,未发现其表现出硫还原或NADH氧化相关活性,其selleck HPLC具体生化功能还有待进一步研究。异源表达TM0754获得Nox蛋白,该蛋白分子量约45 kDa,结合有一分子FMN。Nox不具有还原单质硫或硫代硫酸盐的活性,但却表现出NAD(P)H氧化酶活性,可以直接还原O2生成H2O。在正常厌氧环境下,它的转录水平较高,而当暴露于高氧气浓度环境下时则会降低,这说明这个NADH氧化酶主要用于正常生长条件下少量O2的去除。NfnAB则是一个双亚基的电子歧化的转氢酶,异源表达的NfnAB可以催化NADPH同时还原NAD+和Fdox,该酶在不同的生长条件下均有表达,这表明它在不同条件下的氧化还原平衡调节中都起到了重要的作用。而定点突变实验表明,b-FAD分子的结合对NfnAB的活性至关重要,它的异咯嗪环的N5位点则是电子传递的主要位置。Nfn的同源蛋白广泛分布于厌氧的古菌和细菌中,根据其蛋白序列和结构域排列,可将其分为四种类型,对其中来自Clostridium ljungdahlii的融合型Nfn研究发现,融合型Nfn具有完全一致的电子歧化酶活性,敲除其基因后该菌无法生长,这些结果表明Nfn在厌氧微生物的胞内氧化还原平衡的维持中发挥重要作用。综合上述研究,可以得出一个T.maritira硫还原代谢与氧Sexually transmitted infection化还原平衡的可能代谢机制:T.maritima通过EMP和ED途径降解碳水化合物,产生Fdred、NADH和NADPH三种还原力分子,NADPH可以通过NfnAB将还原力传递给NADH和Fdred。在没有S0和Na2S2O3存在时,NADH和Fdred主要通过电子歧化的氢化酶HydABC产氢释放还原力。当S0存在时,HydABC表达降低,此时NADH主要通过NSR还原硫释放还原力,而Fdred则通过MBX还原硫释放还原力。在Na2S2O3存在时,氢化酶依然发挥作用,同时NSR利用NADH还原硫代硫酸盐释放一部分还原力,多余的Fdred则通过Rnf将电子传递给NADH进一步被释放。在体系中存在微量O2时,可以通过TM0754与TM0755两个基因编码的NADH氧化酶对O2进行清除。对于NSR在微生物中的分布调查研究可以得出,这一硫还原代谢机制可能在地热环境中的异养硫还原菌和硫代硫酸盐还原菌中广泛分布,对于热泉等地热环境中的硫循环发挥重要作用。