目的多发性大动脉炎,又称Takayasu动脉炎(Takayasu’s Arteritis,TAK)是一种慢性进行性自身免疫性炎症疾病。TAK多发于亚洲青年女性,病变以原因不明的肉芽肿性血管炎为主,造成主动脉及其主要分支动脉管壁纤维化、管腔狭窄甚至闭塞;病变可累及全身任何器官,常呈多发性;临床表现因病变累及部位不同而各异,主要表现为相应器官的灌注异常导致的一系列临床症状和并发症,属于临床疑难杂症。然而,由于发病机制不清楚,TAK的临床治疗主要依靠糖皮质激素等非特异性免疫抑制剂,出现并发症只能依靠手术治疗避免疾病进程恶化,这种常规治疗方案并发症较多,达不到个体化治疗的效果,目前临床治疗缺乏靶向性的治疗策略。既往研究已经证明,免疫细胞,尤其是不同种类的T细胞在TAK的发病过程中发挥关键作用。在TAK患者中,受累及的动脉外膜经常被免疫细胞浸润,进而导致血管炎症和相应的器官损伤。辅助性T细胞(T helper cell,Th),包括Th1和Th17,是TAK累及动脉外膜层的主要浸润细胞。在大动脉炎患者的外周血中,Th1和Th17细胞的数量明显提升~([1])。同时,在我们既往实验中观察到,TAK患者T细胞存活时间显著延长,导致炎症反应持续时间延长。因此,分化和维持这种促炎性Th1和Th17细胞亚群的机制研究对于促进我们对TAK病因的理解和随后的治疗探索是相关的。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)通过协调真核细胞的生长、代谢、环境营养素和生长因子,在包括调节蛋白质合成以及自噬的许多基本细胞过程中发挥核心作用~([2-4])。m TOR分为m TORC1和m TORC2。我们既往研究发现,TAK患者CD4~+T细胞内m TORC1过度活跃,导致促炎性T细胞自发分化不良~([5])。使用雷帕霉素或RAPTOR sh RNA抑制m TORC1可消除TAK患者促炎性T细胞的不良分化~([5])。阻断m TORC1可以缓解人源化TAK嵌合小鼠中的人类血管炎症~([5])。因此,我们认为m TORC1过度活跃是TAK患者CD4~+T细胞的关键特征~([5])。然而,导致TAK患者中T细胞m TORC1过度活跃的机制尚不清楚。Notch是一种保守受体,控制包括免疫细胞在内的多种细胞类型的命运和功能~([6-9])。大量研究证据表明Notch信号在CD4~+T细胞分化和功能中起着重要作用~([1,6,10-12])。既往研究发现,在巨细胞动脉炎(Giant Cell Arteritis,GCA)患者中,CD4~+T细胞的Notch-1活性增加,导致促炎性T细胞分化~([6])。在高水平血管内皮生长因子的刺激下,GCA受影响动脉外膜中的微内皮细胞表达Jagged1,形成结构生态位,在接触CD4~+T细胞时诱导Notch-1活性~([6])。GCA患者T细胞的这种Notch-1高活性导致AKT/m TORC1激活,从而促进Th1和Th17细胞亚群的分化~([6])。因此,Notch信号可能是T细胞中m TORC1活性的主要调节器。同时,我们既往研究已经检测到TAK发病过程Notch-1信号异常增强,推测Notch-1可能是调节T细胞m TORC1活性,导致TAK患者促炎性T细胞分化异常的关键分子。腺苷酸活化蛋白激酶(Adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)是能量代谢和线粒体稳态的守护者,它可感知ATP不足和AMP/ATP比率增加,从而启动分解代谢和ATMRTX1133体外P生成。在α-亚基的Thr172部分磷酸化后,AMPK可以磷酸化TSC2和RAPTOR,达到抑制m TOR的激活和稳定性,导致m TOR失活的作用。既往研究表明,AMPK对于所有调节性T细胞的分化都非常关键。经过预实验,我们发现,TAK患者CD4~+T细胞中AMPK活性异常增高。因此,我们推测AMPK信号高表达可能与TAK患者T细胞生存时间延长存在联系。据此,在本次研究中,我们对TAK患者中Notch-1和AMPK两组信号通路活性进行研究,旨在明确TAK患者中T细胞异常活化和生存的机制,探寻临床治疗Takayasu动脉炎的新策略。方法为了明确TAK患者T细胞分化与功能异常的具体机制,我们选取2020年1月至2021年12月,于吉林大学第一医院就诊的TAK患者50名,选取50名年龄、性别匹配的健康对照。同时,招募10名患有肉芽肿性血管炎的患者作为疾病对照,进行了以下实验:第一章、T细胞在TAK患者中的分化与存活特性。1、TAK患者T细胞分化实验:(1)为了确定TAK患者中的CD4~+T细胞是否存在促炎性T细胞亚群分化异常,我们将TAK患者和健康对照的CD4~+T细胞用抗CD3/CD28珠激活后,流式检测Th1和Th17亚群分化情况。(2)为了明确TAK患者CD4~+T细胞内高分化的促炎性T细胞亚群是否具有生物活性,我们检测Th1和Th17细胞亚群的转录因子T-bet和ROR-γ的表达情况。2、TAK患者T细胞存活能力实验:为了明确TAK患者T细胞存活能力,我们使用Annexin V/7-AAD凋零检测试剂盒比较TAK患者和健康对照的激活后的CD4~+T细胞凋亡结果。第二章、TAK患者T细胞分化异常的分子机制。1、TAK患者T细胞中Notch-1活性实验:为了检测TAK患者的促炎性T细胞分化中的Notch-1信号是否存在异常表达,我们分析TAK患者,GPA患者和健康对照CD4~+T细胞内Notch-1和激活Notch-1的表达产物以及与促炎性T细胞之间的关系。2、TAK患者T细胞中Notch-1与促炎性T细胞分化关系实验:(1)为明确Notch-1与促炎性T细胞异常分化之间关系,我们分析TAK患者CD4~+T细胞中激活Notch-1与促炎性T细胞之间的关系。(2)为了进一步证明Notch-1信号与促炎性T细胞分化的关系,我们应用Notch-1胞内结构域(NICD)处理健康CD4~+T细胞,观察促炎性T细胞的分化情况。同时我们敲除TAK患者CD4~+T细胞的Notch-1基因,观察促炎性T细胞的分化情况。3、Notch-1调节促炎性T细胞分化的机制研究:(1)根据既往研究结果,我们假设,Notch-1可能通过调节m TORC1驱动促炎性T细胞分化。为证实该假设,我们应用NICD处理健康CD4~+T细胞,检测细胞内m TOR的m RNA水平、RAPTOR、RICTOR、m TOR、p-S6RP、S6RP、p-AKT和AKT的表达。我们敲除NICD处理的健康CD4~+T细胞中的RAPTOR基因,检测促炎性T细胞分化情况。我们再次敲除TAK患者CD4~+T细胞中的Notch-1基因,检测细胞内p-S6RP、S6RP、p-AKT和AKT的表达以及促炎性T细胞的分化情况。我们同时分析TAK患者的CD4~+T细胞,检测细胞内p-S6RP和激活Notch-1的关系。(2)为探究Notch-1与m TORC1的具体作用机制,我们检测TAK患者CD4~+T细胞中溶酶体m TOR的表达。同时我们应用NICD或DAPT处理健康CD4~+T细胞,检测溶酶体m TOR的表达。第三章、TAK患者T细胞存活异常的分子机制。1、为了明确TAK患者T细胞中AMPK的状态,我们比较TAK患者和健康对照的激活后的CD4~+T细胞中磷酸化AMPK水平、2、为了直接检测AMPK在TAK患者促炎性T细胞存活中的作用,我们在TAK患者CD4~+T细胞中加入复合物C,分析凋亡细胞数量。同时,我们敲除TAK患者CD4~+T细胞AMPK基因,以及应用AMPK激动剂A769662激活健康对照CD4~+T细胞内AMPK,分析T细胞凋亡数量。3、为了明确AMPK延长T细胞生存的具体机制,我们应用seahorse细胞能量代谢分析仪分析TAK患者和健康受试者的T细胞的线粒体耗氧率,同时应用复合物C抑制TAK患者T细胞中AMPK后,再次测定T细胞的线粒体耗氧率。同时,我们应用丙二酸抑制TAK患者T细胞内线粒体三羧酸循环,检测细胞凋亡数量。再同时应用A769662和丙二酸处理TAK患者T细胞后,检测细胞凋亡数量。4、为了探讨TAK患者T细胞中AMPK过度激活的临床相关性,我们分析了TAK临床患者CD4~+T细胞内磷酸化AMPK水平与TAK患者的红细胞沉降率和C反应蛋白的相关性。5、为了探讨AMPK活性异常的分子机制,我们应用DAPT处理TAK患者CD4~+T细胞后,观察细胞内磷酸化AMPK的水平。再应用Notch sh RNA转染TAK患者CD4~+T细胞后,分析细胞内p-AMPKα的表达,同时分析凋亡细胞数量。第四章、基于人源化TAK疾病模型的转化研究。1、原创性构建人源化TAK疾病模型;2、明确Notch-1与人源化TAK疾病模型中促炎性T细胞异常分化之间的关系;3、利用人源化TAK模型对Notch信号进行靶向调控,明确转化价值。结果第一章、T细胞在TAK患者中的分化与存活特性。1、TAK患者T细胞存在自发性促炎性Th1和Th17亚群分化异常:(1)在TAK患者的CD4~+T细胞中,Th1亚群和Th17亚群分化频率较高。(2)与来自健康对照组外周血的CD4~+T细胞相比,TAK患者的CD4~+T细胞表现出转录因子T-bet和ROR-γ的高表达。以上结果证实,TAK患者T细胞内存在Th1和Th17亚群的异常分化。2、TAK患者T细胞存活能力增强:相比健康对照组,TAK患者T细胞凋亡更少。证明TAK患者T细胞的存活能力更强。以上结果证明,TAK患者T细胞的分化和存活能力均异常增强。第二章、TAK患者T细胞分化异常的分子机制。1、TAK患者T细胞中Notch-1活性实验:相比健康对照和GPA患者,TAK患者CD4~+T细胞中Notch-1和激活Notch-1表达更高。相比健康对照,TAK患者CD4~+T细胞中Notch-1的表达水平明显增加。这些结果说明TAK患者中的CD4+T细胞存在Notch-1高表达。2、TAK患者T细胞中Notch-1通路与促炎性T细胞分化关系实验:我们证明,TAK患者CD4~+T细胞内激活Notch-1表达频率与Th1和Th17细胞亚群的分化频率呈正相关。应用NICD处理可以增加TAK患者Th1与Th17细胞亚群分化频率,同时增加T-bet和ROR-γ的表达。使用sh RN购买BMN 673A策略敲除Notch-1基因后,Notch-1的表达被明显抑制,同时Th1与Th17细胞亚群分化被抑制。这些结果说明Notch-1信号调节TAK患者的促炎性T细胞分化。3、Notch-1调节促炎性T细胞分化的机制研究:(1)实验结果显示,通过转染NICD导致的健康CD4~+T细胞中Notch-1高表达,可导致m TOR蛋白表达增加约2-3倍,转染NICD后CD4~+T细胞中m TOR的m RNA水平明显增加。Notch-1高表达增强了RAPTOR的表达,然而RICTOR的表达不受影响。转染NICD的CD4~+T细胞内p-S6RP水平显著升高,p-AKT水平变化无统计学意义。敲除m TORC1的基因,同样可以阻碍Notch-1高表达诱导的促炎性T细胞分化。敲除Notch-1的基因可以有效降低p-S6RP表达水平,而p-AKT表达水平不受影响。在TAK患者的CD4~+T细胞中,细胞内激活Notch-1与p-S6RP呈正相关。结合实验结果,我们证明Notch-1通过调节m TORC1驱动促炎性T细胞分化。(2)实验结果表明,与对照组相比,TAK患者CD4~+T细胞中溶酶体m TOR的表达增加。用NICD转染健康CD4~+T细胞可以导致溶酶体m TOR的表达增加。DAPT通过抑制Notch活性,导致CD4~+T细胞中溶酶体m TOR表达减少。这表明Notch-1通过调节TAK患者T细胞中溶酶体m TOR的表达,调节m TORC1的活性。以上结果证明,TAK患者CD4~+T细胞中存在Notch-1高表达,Notch-1通过调节TAK患者m TORC1活性,调节促炎性T细胞异常分化。第三章、TAK患者T细胞存活异常的分子机制。1、我们发现,TAK患者T细胞中磷酸化AMPK水平明显升高。2、实验结果表明,应用AMPK抑制剂复合物C可以抑制TAK患者T细胞的存活。敲除AMPK基因可影响AMPK的表达,导致TAK患者T细胞凋亡数量增多。激活AMPK可提高健康对照T细胞的存活率。这些结果说明TAK患者T细胞的生存需要AMPK激活。3、应用Seahorse细胞能量代谢分析仪分析结果显示,TAK患者T细胞的线粒体OCR明显增高,表现为基础OCR增高,最大呼吸能力增强。在TAK患者T细胞培养基中加入复合物C,观察到线粒体OCR升高趋势被抑制。三羧酸循环抑制剂丙二酸可以导致T细胞凋亡数量明显增加。在存在AMPK激动剂A769662的情况下,丙二酸仍可以导致T细胞的凋亡数量增加。这些结果说明AMPK通过影响T细胞线粒体代谢达到naïve and primed embryonic stem cells延长T细胞生存时间的结果。4、TAK患者T细胞内磷酸化AMPK水平与同一患者的红细胞沉降率和C反应蛋白水平呈正相关。说明T细胞中的AMPK活性与TAK患者的疾病活动性呈正相关。5、Notch-1可以调节TAK患者T细胞AMPK活性:DAPT显著降低了TAK患者T细胞中磷酸化AMPK水平。敲除Notch-1基因可以降低AMPK活性和促炎性T细胞存活率。这些结果说明Notch-1可以调节TAK患者T细胞AMPK活性。以上结果证实,AMPK过度激活导致TAK患者T细胞存活延长,同时Notch-1信号在T细胞AMPK活性调节中起到重要作用。第四章、基于人源化TAK疾病模型的转化研究。1.在既往研究的基础上,我们再次成功原创性构建人源化TAK疾病模型。2.我们证实,Notch-1信号调节人源化TAK疾病模型促炎性T细胞分化。3.我们证实,在人源化TAK疾病模型中靶向Notch-1治疗,可以抑制促炎性T细胞分化,减轻人类动脉移植物的炎症反应。体内实验结果表明,靶向Notch-1是治疗TAK的一种有前途的治疗策略。结论我们证明,TAK患者T细胞存在促炎性Th1和Th17亚群分化和存活异常。Notch-1通过调节m TORC1激活促炎性T细胞分化,AMPK活性上调是TAK患者T细胞存活延长的基础。Notch-1信号可以调控TAK患者T细胞AMPK活性的作用。体内实验证明,靶向Notch-1可有效缓解人源化TAK嵌合小鼠中的血管炎症。该研究为靶向Notch-1在TAK的临床治疗方面提供了更多理论依据,为TAK的精准治疗提出了新颖且有前景的策略。