Rasd2对慢性不可预知应激小鼠抑郁样行为的影响及其机制研究

研究背景:抑郁症是一种以悲伤、失去兴趣或快乐、低自我价值感、睡眠或食欲紊乱和注意力不集中等为特征的精神疾病。抑郁症为患者及其家庭带来沉重的精神负担和经济负担。因此,抑郁症成为亟待解决的公共卫生问题。临床数据显示,抑郁症患者存在多巴胺及其代谢产物水平下降的改变,且抑郁症与应激之间存在正相关关系。而抑郁症患者的症状如动机缺乏、快感缺失及社交减退,均提示奖赏系统参与了抑郁症的病理生理学。奖赏系统中DRD2水平的变化与抑郁症发生密切相关,激活DRD2可发挥抗抑郁样作用,也可增强其他抗抑郁药物的干预疗效。在我们前期急性禁食抗抑郁样作用及其机制的研究中,转录组学分析结果显示:急性禁食引起PFC内Rasd2的表达发生变化。进一步的研究表明,在卵巢摘除诱导的抑郁模型小鼠中,Rasd2可调节DRD2进而改善小鼠抑郁样行为。此外,一项对慢性温和游泳应激小鼠PFC的转录组学分析中发现,应激可改变小鼠PFC内Rasd2的表达,说明Rasd2很可能参与应激诱导的抑郁样行为机制。Rasd2是RASD亚家族的一员,主要富集于纹状体。Rasd2在中枢神经系统中主要调控多巴胺受体信号通路,可通过调控纹状体c AMP/PKA信号通路,充当多巴胺传递的调节剂。此外,Rasd2还可调节Akt/m TOR信号级联,同时也是PI3K和Akt通路之间的关键桥梁。然而Rasd2在应激诱导的抑郁症中发挥的作用及其潜在的分子和环路机制仍未见报道。研究目的:本研究以慢性不可预知应激(CUMS)小鼠为抑郁模型,通过行为药理学、分子生物学、组织形态学和神经示踪化学遗传学等手段,从整体水平到细胞分子水平再到神经环路水平探讨Rasd2对CUMS小鼠抑郁样行为的影响及其相关机制,为抑郁症的治疗提供新的分子靶点。研究方法:首先通过CUMS构建抑郁模型小鼠,通过行为药理学实验(旷场实验、蔗糖偏好实验、强迫游泳实验和悬尾实验)考察CUMS对小鼠抑郁样行为的影响,并通过酶联免疫吸附实验和免疫组织化学实验分别考察CUMS对小鼠血清内皮质酮水平和抑郁相关脑区内c-Fos表达量的影响,以验证抑郁模型构建成功;随后,通过免疫组织化学实验考察CUMS对小鼠应激相关脑Captisol价格区内Rasd2表达的影响,并通过免疫印迹实验和免疫共沉淀实验探究Rasd2改善CUMS小鼠抑郁样行为的相关分子机制;最后,通过荧光金逆向示踪和免疫荧光实验考察CUMS对NAc core上游核团神经元活化的影响;接下来通过脑立体定位技术构建NAc core内Rasd2过表达/低表达小鼠,通过行为药理学实验考察Rasd2过表达/低表达对CUMS小鼠抑郁样行为的影响;通过免疫印迹实验考察NAc和m PFC内Rasd2、Glu A1以及DRD1/DRD2-c AMP-PKADARPP-32和PI3K-Akt-m TORC1信号通路相关蛋白表达的变化;通过免疫荧光实验探讨Rasd2与DRD2影响CUMS小鼠抑郁样行为的可能机制;进一步的研究通过化学遗传学选择性激活/抑制Pr L-NAc core谷氨酸环路,通过行为药理学实验考察环购买Laduviglusib路的激活或抑Probe based lateral flow biosensor制对CUMS小鼠抑郁样行为的影响;通过免疫荧光实验考察Pr L-NAc core谷氨酸环路激活/抑制对Rasd2阳性神经元与DRD2阳性神经元活化的影响,以探讨Rasd2参与抗抑郁样作用的可能机制;最后基于Drd2-cre转基因小鼠,通过脑立体定位技术,构建Pr L-NAc core神经环路DRD2神经元特异性Rasd2过表达小鼠,通过免疫荧光实验和行为药理学实验考察Pr L-NAc core神经环路DRD2神经元中Rasd2过表达对CUMS诱导的抑郁样行为的影响。研究结果:CUMS诱导小鼠蔗糖偏好降低,悬尾实验和强迫游泳实验不动时间增加,以及强迫游泳实验攀爬时间和游泳时间减少,但对旷场实验中运动距离、水平运动量、垂直运动量和进入中央区域次数均无影响。另外,CUMS诱导血清中皮质酮水平增加以及NAc(core和shell)、m PFC(Cg1、Pr L和IL)以及HP(CA1、CA2、CA3和DG)内c-Fos表达减少。以上结果提示CUMS抑郁模型构建成功。进一步的免疫组织化学实验发现CUMS可降低小鼠NAc(core和shell)和m PFC(Cg1和IL)内Rasd2的表达。在免疫印迹实验中发现,CUMS诱导小鼠NAc中Rasd2、m TORC1和DRD2表达减少,DARPP-32和DRD1表达增加,以及m PFC中Rasd2、Glu A1和m TORC1表达减少,DARPP-32表达增加。此外CUMS降低了NAc中Rasd2和DRD2的相互作用。最后我们通过荧光金逆向追踪NAc core的上游核团,并通过免疫荧光实验考察环路中神经元的活化情况,实验结果发现CUMS通过抑制Pr L-NAc core环路而诱导小鼠产生抑郁样行为。接下来,我们发现NAc core内Rasd2过表达增加了CUMS小鼠对蔗糖的偏好,减少小鼠悬尾实验和强迫游泳实验中的不动时间和攀爬时间,并且增加了游泳时间,而Rasd2低表达对CUMS小鼠则无上述影响。此外,Rasd2过表达或低表达对旷场实验中运动距离、水平运动量、垂直运动量和进入中央区域次数均无影响。免疫印迹实验结果显示,Rasd2过表达减少NAc内DARPP-32的表达,并增加了小鼠m PFC内Glu A1的表达。此外Rasd2过表达激活了NAc内DRD2-c AMP-PKA-DARPP-32和PI3K-Akt-m TORC1信号通路,同时激活了m PFC内PI3K-Akt-m TORC1信号通路,而Rasd2低表达仅抑制了NAc内PI3K-Akt-m TORC1信号通路。另外Rasd2过表达增加了CUMS小鼠NAc core内Rasd2和DRD2共定位。进一步的实验中发现,选择性激活Pr L-NAc core谷氨酸环路可减轻CUMS小鼠抑郁样行为,表现为蔗糖偏好增加,不动时间减少(悬尾实验和游泳实验)以及游泳时间的增加。并且激活或抑制Pr L-NAc core谷氨酸环路并未对小鼠旷场实验中运动距离、水平运动量、垂直运动量和进入中央区域次数产生影响。此外,激活或抑制Pr L-NAc core谷氨酸环路分别诱导小鼠NAc core内Rasd2阳性神经元和DRD2阳性神经元活化的增加或减少。最后,Pr L-NAc core神经环路中DRD2神经元特异性Rasd2过表达增加了小鼠NAc core内DRD2与Rasd2共定位,并且增加了小鼠对蔗糖的偏好,减少了悬尾实验和强迫游泳的不动时间,同时增加了强迫游泳实验中攀爬时间和游泳时间。研究结论:综上所述,我们的研究揭示了CUMS减少小鼠NAc和m PFC内Rasd2的表达,并通过抑制Pr L-NAc core神经环路进而诱导小鼠产生抑郁样行为。同时,NAc core内Rasd2过表达对CUMS小鼠抑郁样行为有改善作用,这种作用是通过DRD2-c AMP-PKA-DARPP-32和PI3K-Akt-m TORC1信号通路介导的。此外,Pr L-NAc core谷氨酸环路的激活可通过活化NAc core内Rasd2阳性神经元和DRD2阳性神经元进一步产生抗抑郁样作用。本研究还验证了DRD2神经元中Rasd2过表达可调控Pr L-NAc core环路,进一步减轻抑郁样行为。这项研究突出了Rasd2在改善应激诱导的抑郁样行为中的重要作用,为抗抑郁药物的研发提供了理论依据。