多环大环内酰胺(polycyclic tetramate macrolactam,PoTeM)是一类具有特特拉姆酸结构单元及多环体系的大环内酰胺,其化学结构新颖、生物活性广泛,具有良好开发前景。PeToMs根据多环体系不同,分为5-5双环、5-5-6三环和5-6-5三环等结构亚型。生物合成研究发现,醇脱氢酶OX4负责5-5-6三环HSAF内侧六元环合成,醇脱氢酶CftD催化5-6-5三环ikarugamycin的内侧五元环合成。目前,PoTeMs相关醇脱氢酶尚无蛋白结构报道,OX4与CftD及其同源蛋白催化还原环化反应的分子机制和底物选择性机制尚未阐明。基于上述研究背景,本论文开展了以下三方面的工作:1.醇脱氢酶OX4三元复合物及CftD的晶体结构研究。通过蛋白的表达纯化、蛋白晶体筛选优化、以及晶体衍射数据收集处理,成功获得并解析三元复合物OX4-NADP+-3-deOH ATC(2.3 A)、OX4-NADP+-3-deOHATB(2.8 A)、OX4-NADP+-3-deOH HSAF(2.6A)、OX4-NADP+-Y1(3.2A)和 apo CftD(2.0 A)的晶体结构。结构分析发现,OX4和CftD属于非锌依赖的醇脱氢酶,每条链含有一个催化结构域和一个核苷酸结合结构域,二者被一个疏水的裂隙分开。OX4三元复合物中底物和NADPH以T字形结合在上述裂隙区域。2.醇脱氢酶OX4的催化机理。1)通过分析OX4中可能定位NADPH的氨基酸残基和NADPH相关突变体体外功能,推测OX4中的G169和K195决定其更倾向于利用NADPH。2)通过分析OX4三元复合物结构,确定NADPH供氢的烟酰胺环C4接近底物受氢的C21位,为OX4的底物区域选择性提供了结构支撑。3)通过对比分析三元复合物结构和底物相关突变体体外功能immune-based therapy,发现OX4反应中的氢化物转移和质子传递均无氨基酸残基介导,因此质子可能直接来自溶剂水;底物结合口袋的氨基酸残基除W260外,可能仅通过影响底物与蛋白的结合而影响酶活。4)由于OX4W260F和CftDW261A均仅催化双键还原反应,结合可能的反应中间体结构,推测该保守色氨酸可能通过与底物C-1位羰基形成氢键,稳定反应过程中的烯醇式过渡态。5)通过比对3-deOH ATC和3-deOHATB的三元复合物结构,发现底物立体构型不同导致其在复合物中的摆放方式不同,可能造成了 OX4的底物立体选择性。3.醇脱氢酶OX4与CftD的底物环系选择性机制。通过蛋白结构和序列对比,定位了三个可能影响醇脱氢酶OX4与CftD底物环系选择性的氨基酸loop区域,并构建了相应loop区域互换的OX4和CftD突变体。体外酶活显示,CftDLEE011突变体C-3的底物环系选择性转变为与OX4一致。由此,推测决定OX4与CftD底物环系选择性的氨基酸loop区域为 loop291-300MK-1775试剂(CftD 中为 loop292-301)。综上所述,本论文基于PoTeMs生物合成研究基础,通过开展醇脱氢酶OX4三元复合物和apo CftD的结构生物学研究和突变体体外功能评价,初步解析了 PoTeMs相关醇脱氢酶OX4和CftD独特的还原环化反应机理和底物选择性机制。本研究,不仅为同类蛋白结构的获取提供了经验,拓宽了对醇脱氢酶催化机制的理解,而且为后续PoTeMs多环体系改造提供了结构基础和理论依据。