PfAgo是来源于嗜热古生火球菌Pyrococcus furiosus的Argonaute蛋白,在引导DNA的引导下能够特异性识别和切割靶标DNA。PfAgo因具有出色的热稳定性,是目前研究和应用最为广泛的原核Ago之一。关于PfAgo的相关研究均表示其需要通过二价阳离子Mn~(2+)或Co~(2+)来发挥其DNA内切酶活性,但与PfAgo同源性较高的一些p Agos均可在Mg~(2+)环境下发挥活性,根据进化关系和催化位点推测PfAgo也应该在某种特定盐浓度、p H下可以依赖Mg~(2+)发挥活性。另外,Mg~(2+)是大多数聚合酶所依赖的金属离子,因此若能找到PfAgo在Mg~(2+)环境下发挥活性的缓冲液并了解相关性质,使其与聚合酶共同工作,能在一定程度上扩大其应用范围。同时Mn~(2+)、Co~(2+)属于重金属,对生物体有严重毒性,所以若能在Mg~(2+)条件下发挥活性,PfAgo将有潜力成为基因编辑的工具。本论文即通过构建PfAgo表达载体、对PfAgo进行表达与纯化,得到可供后续实验使用的共约0.4毫克PfAgo蛋白,尝试了多种不同的含Mg~(2+)的聚合酶缓冲液,确定了能使PfAgo发挥活性的Pfu Buffer,在此条件下研究了https://www.selleck.cn/products/diabzi-sting-agonist-compound-3.htmlPfAgo切割双链DNA的相关性质,例如PfAgo可以在18-50nt长度范围的GDC-0068化学结构g DNA引导下发挥切割双链活性,长度越长会降低切割效率;PfAgo在Pfu Buffer下切割双链同样需要磷酸化g DNA,非磷酸化的g DNA介导下PfAgo没有切割双链的活性;primiparous Mediterranean buffalo在Pfu Buffer下PfAgo能够在65℃以上保持较高的切割单链活性,本研究中未测试更低温度,而由于双链解链的影响,完全切割双链只能在90℃以上;不同位点会轻微影响PfAgo的切割效率。另外,为了进一步比较Mg~(2+)和Mn~(2+)对PfAgo活性的影响,通过识别单核苷酸突变的实验表明Mg~(2+)和Mn~(2+)条件下PfAgo均有识别单核苷酸突变的敏感度。基于以上性质,应用PfAgo与Pfu酶在Pfu Buffer下共同工作,可识别300copies的模板,提高了PCR灵敏度,拓展了PfAgo的应用范围,为其在体外诊断、克隆构建等更多方面发挥更好的作用。