SRC信号通路

为了探索脑梗死首次发作的患者复发的危险因素，为改善脑梗死患者预后、降低脑梗死患者复发率提供科学依据，在山东省某中医院住院电子病历系统中，回顾性检索2017—2019年首次因脑梗死住院的患者，依据脑梗死有无复发将患者划分2组，运用Mann-Whitney U检验、χ~2检验进行统计分析、二元Logistic回归模型和Cox比例风险回归模型分别对影响脑梗死患者复发的危险因素和影响复发天数的因素进行探索。最终纳入首次因脑梗死发作住院selleck PF-03084014的患者4597例，其中“脑梗死有复发组”患者618例（13.44%），“脑梗死无复发组”患者3979例（86.56%），二元Logistic回归模型分析显示住院天数（OR=1.035）、合并2型糖尿病（OR=2.695）、出院带中药汤剂（OR=3.272）、血小板计数（microbiota stratificationPLT）(OR=2.628)是导致脑梗死患者复发的危险因素。Cox比例风险回归模型分析结果显示首次发病时住院天数（HR=1.009）是影响脑梗死患者复发天数的促进因素，出院带中药汤剂（HR=0.509）是影Dolutegravir研究购买响脑梗死患者复发天数的阻碍因素。研究证明脑梗死患者出院后使用中药汤剂调理可延缓脑梗死复发天数，同时应注重患者合并疾病的治疗，保证患者病情稳定后办理出院，出院时应制定完善的出院医嘱，包括合并疾病的用药、抗血小板治疗等，改善患者预后、降低复发及再入院率，减轻患者的疾病负担。

目的 分析伴扁桃体肥大的睡眠呼吸障碍患儿平均血小板体SAHA使用方法积(MPV)和血小板分布宽度(PDW)变化的意义。方法 选取2019年1月—2021年1月湖州市第一人民医院收治的60例伴扁桃体肥大的睡眠呼吸障碍患儿为观察组；选取同期在该院检查的60例非扁桃体肥大的睡眠呼吸障碍患儿(因鼻骨骨折、先天性鳃裂瘘管及外耳道异物等疾病入院者)为对照组，患儿的腺样体经鼻内镜检查，扁桃体常规目测确诊；选取同期在该院检查的60例健康儿童为健康组。比较3组儿童血常规各项指标，分析伴扁桃体肥大的睡眠呼吸障碍与MPV、PDW的关系。结果 3组儿童白细胞计数、中性粒细胞计数、淋巴细胞计数、单核细胞计数、单核细胞计数、嗜酸性粒细胞、红细胞计Biopsia pulmonar transbronquial数、红细胞分布宽度SD值、红细胞比容、平均红细胞体积、血红蛋白、血小板计数、血小板与淋巴细胞比率、中性粒细胞与淋巴细胞比率等血常规指标比较，差异均无统计学意义(均P>0.05);观察组患儿MPV[(9.46±1.32)fl]和PDW[(14.59±0.22)fl]水平低于对照组[(10.44±1.50)fl、(15.22±0.48)fl]和健康组[(10.69±1.32)fl、(16.25±0.51)fl],差异均有统计学意义(F=13.265、234.556,均P<0.0点击此处5)。经过Pearson积差相关分析发现，MPV、PDW与扁桃体肥大等级均呈负相关关系(均P<0.05)。MPV、PDW联合检测在睡眠呼吸障患儿扁桃体肥大诊断评估中的ROC曲线线下面积(AUC)为0.935,特异度为92.50%,灵敏度为95.00%。结论 睡眠呼吸障碍儿童扁桃体肥大的发生与MPV、PDW存在一定关系，MPV、PDW可作为判断该病的指标。伴扁桃体肥大的睡眠呼吸障碍患儿MPV、PDW水平变化可能是机体对血液高凝状态的对抗代偿机制，MPV、PDW可作为评价伴扁桃体肥大的睡眠呼吸障碍疾病严重程度的潜在指标。

目的 分析重度子痫前期死胎患者的临床特征，从而加强对重度子痫前期不良妊娠结局的预防。方法 收集2006年1月—2017年1月于大连医科大学附属第一医院收治的91例重度子痫前期死胎患者的病例资料，包括患者的年龄、血压、孕/产次、病史、产检情况、临床表现、孕妇并发症及实验Phage time-resolved fluoroimmunoassay室指标等，并对以上数据进行统计学分析。结果 91例患者中初产妇占56.04%,经产妇占43.96%,不规律产检者占59.30%,出现症状不及时就诊者占61.5%,平均血压(183.51±23.46)/(120.76±18.82)mm Hg,平均发病孕周(25.04±4.05)周。重度子痫前期胎儿死亡患者最多见的临床表现为头晕头痛(61.54%),其次为进行性水肿(48.35%),出现恶心呕吐表现的患者中16例并发HELLP综合征(59.26%),与无此表现的患者相比差异有统计学意义(P<0.05)。13例出现胸闷气短的患者有3例出现心功能不全(23.08%),与无此表现的患者相比差异有统计学意义(P<0.05)。血小板≤100×10~9/L中有9例发生HELLP综合征，与血小板>10LGK-974半抑制浓度0×10~9/L患者相比差异具有统计学意义(P<0.01)。57例LDH>300 U/L中32例并发HELLP综合征，与LDH≤300 U/L患者相比差异有统计学意义(P<0.01)。91例重度子痫前期患者共93个围生儿，其中27例死胎(29%),65例因母亲病情因素或胎儿因素引产，另有CL 318952价格1例新生儿死亡(1%)。结论 对于重度子痫前期孕妇应重视临床症状及实验室指标的变化(尤其血小板和ALT),孕期做好规律且有质量的产前检查对于重度子痫前期不良结局的预防有着重要意义。

目的 从核因子E2相关因子2(Nrf2) /胱氨酸谷氨酸反向转运蛋白（xCT）/谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)信号通路探讨血管软化丸对ApoE~(-/-)动脉粥样硬化小鼠铁死亡的作用及分子机制。方法 C57BL/6J雄性小鼠普通饲料喂养为正常组，ApoE~(-/-)小鼠按照高脂饲料喂养12周制作动物模型，随机数字表法将50只ApoE~(-/-)小鼠分为模型组、血管软化丸低剂量（2.34 g/kg）组、血管软化丸高剂量（4.68 g/kg）组、血管软化丸高剂量联合Nrf2抑制剂ML385（30 mg/kg）组、铁死亡抑制剂（1 mg/kg）组，每组10只，连续干预6周。采用全自动血脂分析仪检测血脂水平[甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)]，油红O染色观察主动脉脂质沉积状况，苏木素-伊红（HE）染色观察主动脉窦组织形态学变化，比色法检测各组小鼠血清中Fe~(2+)、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）水平，免疫荧光观察各组小鼠主动脉窦铁蛋白重链(FTH1)和铁蛋白轻链(FTL)蛋白表达，蛋白质印迹法（Western blotting）检测小鼠主动脉组织Nrf2、xCT、GPX4蛋白水平，透射电镜观察主动脉线粒体超微结构改变。结果 与正常组小鼠比较，模型组小鼠主动脉可见明显脂质斑块沉积、主动脉窦钙化病变严重，血清TC、TG、LDL-C、Fe~(2+)、MDA水平均升高，HDL-C、SOD、GSH水平下降（P＜0.01），主动脉组织Nrf2、xCT、GPX4蛋白及铁储存蛋白FTH1、FTL表达下降（P＜0.01）；与模型组小鼠相比，血管软化丸低、高剂量组及铁死亡抑制剂组小鼠治疗后主动脉斑块面积占比下降、主动脉窦钙化病变有所减轻，血清TC、TG、LDL-C、Fe~(2+)、MDA水平下降，HDL-C、SOD、GSH水平升高，差异均具有统计学意义（Oncologic treatment resistanceP<0.05或P＜0.01），主动脉组织Nrf2、xCT、GPX4蛋白及铁储存蛋白FTH1、FTL阳性表达上调，差异均有统计学意义（P<0.05或P＜0.01）；与血管软化丸高剂量组小鼠相比，NNSC 125973采购rf2抑制剂TalazoparibML385组小鼠血脂及脂质过氧化水平有所增加，主动脉组织Nrf2、xCT、GPX4蛋白及铁储存蛋白FTH1、FTL阳性表达下降（P＜0.01），可逆转血管软化丸对AS小鼠的治疗作用。结论 血管软化丸可改善AS小鼠血脂水平、减少动脉斑块病变程度，其作用机制可能与激活Nrf2/xCT/GPX4通路抑制铁死亡有关。

目的 探讨PLT、透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原N端肽(PⅢNP)、IV型胶原(CIV)、脾脏直径(SD)、肝脏硬度值(LSM)以及联合LSM、SD、PLT获得的LSP评分等肝纤维化指标对乙型肝炎肝硬化(HBC)患者食管静脉曲张(EV)的评价作用。方法 回顾2019年1月—2022年3月在北大医疗淄博医院住院治疗的162例HBC患者资料，其中男105例、女57例，年龄54(40,76)岁。HBC符合诊断要求。依据胃镜情况进行EV分组。结果 162例HBC患者中无EV、轻中度EV以及重度EV分别为27例、59例及76例。无EV组、轻中度EV组和重度EV组PLT为122(76,140)×10~9/L、76(56,102)×10~9/L及58(44,81)×10~9/L,差异具有统计学意义(P<0.05);无EV组HA、LN、PⅢNP及CIV分别为258.2(105.6,580.5)、107.5(60.7,142.9)、14.0(6.8,17.2)及128.0(63.2,264.5)μg/mL,分别与轻中度EV组[352.4(167.0,627.8)、140.2(69.8,188.5)、16.2(7.3,33.5)及153.2(84.8,229.9)μg/mL]、重度EV组[640.2(290.2,918.7)、158.7(94.6,236.4)、19.6(9.5,47.5)及180.7(119.0,282.6)μg/mL]相比，差异具有统计学意义(P<0.05);无EV组、轻中度EV组和重度EV组SD为13.2(Resting-state EEG biomarkers10.8,15.0)、14.4(11.4,16.0)及15.8(14.6,1Panobinostat7.2)cm,差异具有统计学意义(P<0.05);无EV组LSM及LSP评分分别为14.8(10.6,24.0)kPa及1.9(1.0,3.5)分，分别与轻中度EV组[24.7(17.8,29.5)kPa及4.6(2.4,7.2)分]、重度EV组[37.2(28.8,42.6)kPa及10.0(6.2,14.2)分]相比，差异具有统计学意义(P<0.05)。分析上述肝纤维化指标与EV程度的相关性，结果显示SD、LSM及LSPS与EV程度呈中度正相关(r=0.51、0.63及0.67,P<0.05),HA、LN、PⅢNP及CIV与EV程度呈弱正相关(r=0.25、0.28、0.21及0.23,P<0.05),而PLT与EV程度呈中度负相关(r=-0.41,P<0.05)。PLT、HA、LN、PⅢNP、CIV、SD、LSM及LSP评分诊断EV存在的AUC值分别为0.77、0.65、0.64、0.61、0.59、0.77、0.84及0.87;PLT、HA、LN、PⅢNP、CIV、SD、LSM及LSP评分诊断重度EV的AUC值分别为0.71、0.64、0.59、0.62、0.60、0.77、0.84及0.86。结论 PLT、HA、LN、PⅢNP、CIV、SD、LSM及LSP评分与HBC患者E获悉更多V状态具有相关性，其中LSP评分对EV存在及重度EV的诊断效能较佳，对HBC患者治疗具有指导意义。

在有性生殖过程中,陆生植物面临着一系列不同于水生环境的非生物胁迫,包括干旱、极端温度和更强的紫外线。这些环境压力会对植物的生存产生不利影响。孢粉素是陆生植物孢子/花粉外壁的主要构成物质,也是其抵抗陆地逆境的主要结构之一。实验室前期研究发现拟南芥转录因子AMS与MS188在花药绒毡层中发挥重要作用,调控花粉外壁的形成以及黄酮的合成。在拟南芥中,我们发现花粉中的柚皮素具有吸收紫外线的化学性质,保护花粉抵抗紫外辐射;而黄酮醇具有抗氧化特性,保护花粉免受活性氧(ROS)的损害。苔藓植物是一类早期分化(early-diverging)的陆生非维管束植物,单倍体世代占生活史主要地位,并依靠孢子进行远距离的传播。蛋白序列同源性分析表明苔藓植物中也有AMS与MS188的同源基因。为了研究转录因子AMS和MS188在苔藓中的生物学功能,我们选择地钱(Marchantia polymorpha)和小立碗藓(Physcomitrium patens)这两种模式苔藓植物为研究对象,建立了地钱和小立碗藓的实验室培养和有性生殖诱导体系。通过荧光染色观察了小立碗藓孢子囊发育过程,将其分为了10个时期。此外,我们还在实验室内改进了这两种植物的转基因技术,构建了苔藓中AMS和MS188同源基因的荧光蛋白融合载体,成功获得了荧光报告植物。通过激光共聚焦显微镜观察融合荧光蛋白的组织定位,我们发现AMS和MS188的同源蛋白也在苔藓植物的有性生殖过程中表达。为了获得用于研究小立碗藓基AM-2282细胞培养因生物学功能的多重突变体,我们改造了小立碗藓的CRISPR-Cas9敲除载体,构建了利用内源t RNA酶介导的CRISPR系统,该系统的g RNA被t RNA间隔开,在植物体内由tsandwich bioassay RNA酶剪切t RNA后释放g RNA。利用这套系统,我们成功获得了小立碗藓PpmsRSL3体内188三重突变植株和Ppams双重突变体植株。在蛋白功能研究方面,我们体外表达了地钱中的MS188蛋白。为了研究地钱MS188蛋白(Mp MS188)与At MS188蛋白本身的结构和结合的DNA序列是否保守,我们使用DNA亲和纯化测序(DAP-seq)技术,解析了地钱MS188蛋白结合的拟南芥植物基因组DNA。结果显示,地钱MS188蛋白与拟南芥MS188蛋白结合的motif相似,且同样结合于At MS188下游基因的启动子上,表明MS188蛋白本身结构保守。我们的工作初步表明苔藓植物中AMS/MS188蛋白可能也调控有性生殖过程。

目的:研究黄柏酮对小鼠梗阻性肾病间质纤维化的作用及其作用机制。方法:建立SPF级C57BL/6小鼠的梗阻性肾病UUO模型,30只雄性小鼠被随机分为假手术组、模型组、黄柏酮低剂量组(10mg/kg/d)、黄柏酮高剂量组(40mg/kg/d)和厄贝沙坦组(阳性药物对照,20mg/kg/d)。术后腹腔注射给药,连续7日,每日一次,假手术组和模型组给予等体积生理盐水。reuse of medicines术后第7天,小鼠麻醉后心脏采血并处死摘取肾脏用于后续实验。检测小鼠肾脏组织组织Fe~(2+)浓度、血清丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)水平,组织切片行HE、Masson色观察肾脏结构改变;免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)、蛋白印迹(Western Blot,WB)、实时荧光定量聚合酶链反应(Quantitative real-time polymerase chainreaction,RT-q PCR)Entinostat MW检测肾脏纤连蛋白(Fiselleck激酶抑制剂bronectin,Fn)、α-平滑肌肌动蛋白(Alpha-smooth muscle actin,α-SMA)、核因子E2相关因子2(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)、谷胱甘肽过氧化酶4(Glutathione peroxidase 4,GPx4)、溶质载体家族7成员11(Recombinant solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)的表达。为进一步验证黄柏酮相关作用机制,建立梗阻性肾病UUO模型,小鼠随机分为假手术组、模型组、黄柏酮组(40mg/kg/d)和黄柏酮+Nrf2抑制剂组(黄柏酮40mg/kg/d,Nrf2抑制剂30mg/kg/d),术后腹腔注射给药,黄柏酮与Nrf2抑制剂给药时间间隔2小时,余方法同上述。检测血清MDA和SOD,天狼猩红染色观察肾脏胶原沉积;WB、RT-q PCR检测Fn、α-SMA、Nrf2、GPx4的表达。结果:与模型组相比,黄柏酮低、高剂量组小鼠Fe~(2+)浓度、MDA含量明显减少,SOD活力明显升高,肾脏组织纤维化程度及纤维化指标明显减少,黄柏酮低、高剂量组小鼠肾脏组织Nrf2、GPx4表达明显增加。与黄柏酮高剂量组相比,黄柏酮+Nrf2抑制剂组小鼠MDA含量明显增加,SOD活力明显降低,肾脏组织纤维化程度及纤维化指标明显增加,Nrf2、GPx4表达明显降低。结论1.黄柏酮可延缓UUO小鼠肾间质纤维化的进展;2.黄柏酮通过激活Nrf2调节Nrf2-GPx4通路,抑制UUO小鼠肾脏发生的铁死亡,发挥抗肾纤维化作用。

目的 比较七氟醚吸入麻醉和丙泊酚全凭静脉麻醉对开放腰椎融合手术患者内皮细胞糖萼蛋白syndecan-1、透明质酸和硫酸乙酰肝素脱落的影响。方selleck NSC125066法 择取解放军总医院第六医学中心拟行开放腰椎融合手术患者100例，随机分为吸入麻醉组(n=50)和全凭静脉麻醉组(n=50),分别给予七氟醚/瑞芬太尼和丙泊酚/瑞芬太尼维持麻醉。在术前、手术结束、术后第1天检测血清内皮损伤标记物syndecan-1、透明质E-616452 NMR酸、硫酸乙酰肝素和炎症因子C反应蛋白(CRP)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-6(IL-6)的表达。结果 与术前相比，手术结束bioanalytical method validation时两组患者血清syndecan-1、透明质酸和硫酸乙酰肝素表达明显升高，且术后第1天仍然高于术前基础值。全凭静脉麻醉组在手术结束时syndecan-1[(14.96±2.79)ng/ml]、透明质酸[(195.94±8.64)ng/ml]和硫酸乙酰肝素[(3429.58±310.52)pg/ml]明显低于吸入麻醉组[(17.45±1.65)ng/ml、(203.23±12.93)ng/ml、(3751.12±223.22)pg/ml],(P<0.05),但在术后第1天两组之间没有统计学差异。两组之间CRP、TNF-α和IL-6在各时间点均无统计学差异。结论 全凭静脉麻醉在术中保护内皮糖萼方面可能优于吸入性麻醉，但两种麻醉方法均不能阻止开放腰椎融合手术患者内皮细胞syndecan-1、透明质酸和硫酸乙酰肝素的脱落。

目的:青蒿素类药物(artemisinin drugs,ARTs)被世卫组织推荐为抗疟的一线药物,然而随着广泛使用,在部分地区出现了对ARTs耐药的恶性疟原虫株,导致其药效下降。有研究发现,恶性疟原虫株Pfkelch13基因突变导致编码的kelch13蛋白突变与青蒿素类药物耐药直接相关。Pf K13蛋白突变导致Pf K13蛋白与疟原虫磷脂酰肌醇3-激酶(PfPI3K)结合力下降,PfPI3K泛素化降解减少,PfPI3K水平升高继而介导磷脂酰肌醇-3-磷酸(Phosphatidylinositol 3-phosphate,PI3P)过量。PfPI3K与PI3P抑制了血红蛋白向疟原虫的转运,使疟原虫环状体期发育停滞,对ARTs敏感性下降,另外,血红蛋白内吞减少使得亚铁血红素含量降低,ARTs活化受阻,导致其耐药性的出现,疗效下降。PfPI3K和人类PI3K的蛋白序列高度同源,尤其与Ⅲ型PI3K的结构更为相似,3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)作为一种广谱的PI3K抑制剂,可通过抑制P13K/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路,下调PI3K的表达,鉴于PfPI3K和人类PI3K的蛋白序列高度同源,利用3-MA的抑制作用有望逆转ARTs的耐药性。双氢青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)作为广泛使用的抗疟一线药物,同样受到耐药性困扰,为了解决恶性疟原虫对ARTs的耐药性,提高ARTs的抗疟疗效,拟将二者联合用药。首先构建了伯氏疟原虫K173抗性虫株动物模型,并对其进行抗性诱导,而后将两者单独给药得到各自ED_(50)并进行联合给药,得到其联合用药指数。二者呈现协同给药,后续拟设计DHA与3-MA前药,由于DHA羟基不易与3-MA氨基反应,但是DHA前药青蒿琥酯(artesunate,AS)有羧基,容易发生酰胺化反应,以AS为原料药,通过与3-MA酰胺化反应得到DHA-3-MA的前药AS-3-MA(artesunate-3-Methyladenine,AS-3-MA)。恶性疟原虫在感染红细胞后,会在红细胞膜表面表达恶性疟原虫红细胞膜蛋白-1(Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1,Pf EMP-1),肝素能够与之特异性结合,为提高后续制剂对恶性疟原虫感染红细胞的靶向性,我们在此利用肝素修饰纳米脂质体以提高其靶向性。首先制备了双氢青蒿素-3-甲基腺嘌呤前药纳米脂质体(artesunate-3-methyladenine nanoliposomes,AMLs)及肝素修饰的双氢青蒿素-3-甲基腺嘌呤前药纳米脂质体(heparin-modified artesunate-3-methyladenine nanoliposomes,HAMLs),并对HAMLs进行了处方优化。并考察了HAMLs制剂学特性、抗吞噬、体外靶向性、长循环等,为其后续用于抗疟治疗提供了基础依据。方法:1.DHA与3-MA协同给药评价首先构建了伯氏疟原虫K173抗性虫株动物模型,并通过动物模型对其进行抗性诱导,在诱导到十代后检测抗性指数呈中度抗性。然后构建了伯氏疟原虫K173抗性虫株动物模型,并将DHA与3-MA单独给药得到,各自的ED_(50)值。依据得到的ED值,设置二者以等摩尔比方式给药及等ED_(50)给药两种方式下的给药剂量,二者按照等摩尔比给药时的剂量为:(0.55、1.1、2.2、4.4、8.8)μmol/kg;按照等ED_(50)给药时的剂量分别为:1/4 ED_(50)、1/2 ED_(50)、E D_(50)、2E D_(50)、4 ED_(50)。利用动物模型,根据给药剂量及停药后的抑制率得到二者协同作用指数(combination index,CI)。2.AS-3-MA的合成以AS与3-MA为原料药,2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)为缩合剂,N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)为质子清除剂,通过酰胺化反应合成AS-3-MA。后采用傅里叶红外光谱(FT-IR)、高分辨质谱(HR-MS)、核磁共振氢谱(~1H-NMR)、碳谱(~(13)C-NMR)对其结构进行了鉴定。3.双氢青蒿素-3-甲基腺嘌呤前药纳米脂质体的制备及制剂学特性采用薄膜分散法制备AMLs,以粒径(Size)、多分散指数(PDI)为考察指标,进行单因素优化后进行了响应面优化,得到AMLs较优处方。采用傅里叶红外光谱(FT-IR)对AMLs进行了表征,然后考察了AMLs稀释稳定性、血清中物理稳定性、储存稳定性及体外释放。4.肝素修饰的双氢青蒿素-3-甲基腺嘌呤前药纳米脂质体的制备及制剂学考察采用薄膜分散法制备得到包载胆碱衍生物与AS-3-MA的纳米脂质体,而后将其与肝素钠溶液在室温下共孵育24 h,通过离心除去游离的肝素钠,得到HAMLs。通过透射电镜观察了其形貌;利用马尔文粒度仪测定了HAMLs的Size、PDI及Zeta电位;考察了其稀释稳定性、血清中物理稳定性;用透析法考察了AMLs与HAMLs的体外释放;进行了HAMLs的体外溶血性试验。5.肝素修饰的纳米脂质体的体外靶向性、抗吞噬及长循环考察用香豆素-6(coumarin 6,C6)代替AS-3-MA,通过薄膜分散法制备包载C6的荧光纳米脂质体C6Ls(coumarin 6 nanoliposomes,C6Ls)及载胆碱衍生物与C6的荧光纳米脂质体,将后者与肝素钠溶液共孵育,通过静电吸附作用结合得到肝素修饰的荧光纳米脂质体(heparin-modified choline derivative/coumarin 6 nanoliposomes,HC6Ls);将HC6Ls与伯氏疟原虫K173抗性虫株感染的红细胞共孵育,高内涵成像系统分析肝素修饰的荧光纳米脂质体对被感染红细胞的靶向作用;体外培养RAW264.7细胞对HC6Ls的体外抗吞噬进行考察,高内涵成像系统观察其抗吞噬情况;使用C6作为荧光标记物,制备了肝素修饰的荧光纳米脂质体HC6Ls,这种纳米脂质体可以通过C6的荧光信号被追踪和检测。正常C57小鼠尾静脉注射HC6Ls 0.15m L,采取不同时间点采集血液样本的策略,并利用酶标仪测量各孔的荧光强度。通过这种方法,跟踪纳米脂质体Antigen-specific immunotherapy的代谢情况,评估其在体内的停留时间和稳定性,以考察其长循环。6.肝素修饰的纳米脂质体的抗疟药效利用前期经过抗性诱导后的伯氏疟原虫K173抗性虫株构建C57疟鼠模型,尾静脉注射不同剂量的AS-3-MA溶液、估计剂量的DHA溶液(8.8μmol/kg)、AMLs及HAMLs纳米脂质体,采用皮尔逊四天抑制法连续给药四天,于停药第四天,小鼠尾尖取血、甲醇固定、涂片、染色镜检,计算小鼠体内的疟原虫感染率与抑制百分比,得到AMLs与HAMLs的ED_(50)值;并持续考察疟鼠组、AMLs组与HAMLs组在35天内各组鼠的存活只数,记录并绘制生存曲线。于停药第15天,采集了正常鼠、疟鼠组、DHA溶液组、AMLs组与HAMLs组小鼠的肝、脾、肺、肾组织,石蜡包埋切片而后H&E染色,进行组织病理分析后,初步评价制剂的安全性。结果:1.DHA与3-MA协同抗疟作用利用诱导后的伯氏疟原虫K173抗性虫株构建C57疟鼠模型,给与DHA与3-MA单独治疗,得到二者的ED_(50)值,分别为:(2.71±0.06)μmol/kg、(83.61±1.36)μmol/kg。按照等摩尔比方式给药,剂量由低到高(0.55、1.1、2.2、4.4、8.8)μmol/kg,DHA与3-MA对疟鼠的抑制率分别为:35.6%、49.0%、70.0%、86.5%、94.0%,二者的协同作用指数分别为:0.68、0.87、0.85、0.86、0.74,呈现出较弱的协同作用;按照等ED_(50)方式给药,剂量按照1/4 ED_(50)、1/2 ED_(50)、ED_(50)、2 ED_(50)、4ED_(50)由低到高,二者联合给药对疟鼠的抑制率分别为:47.1%、60.0%、74.0%、85.3%、94.8%,协同作用指数分别为:0.57、0.73、0.78、0.84、0.58表现出协同作用,为后续试验提供了基础。2.AS-3-MA的合成傅里叶红外光谱图中,1720 cm~(-1)的吸收峰表示羰基上的N-H基团的伸缩振动,2928 cm~(-1)处的吸收峰表示酰胺键上的N-H基团的伸缩振动,而1253 cm~(-1)处的吸收峰表示酰胺键上的C-N键的伸缩振动;HR-MS测量得到的精确质量数与理论值的相对误差在一个数量级内;核磁共振氢谱~1H-NMR和碳谱~(13)C-NMR的谱图结果与所期望的化合物结构一致。综合表明成功合成了AS-3-MA。酰胺化反应合成AS-3-MA的产率较低,不足10%,合成工艺有待优化。3.双氢青蒿素-3-甲基腺嘌呤前药纳米脂质体的制备及制剂学特性成功建立了AS-3-MA的HPLC方法,用于AS-3-MA含量测定及体外分析。在8.0～600μg/m L的浓度范围内,AS-3-MA线性良好;其检测限为4μg/m L,定量限为8μg/m L;所建立的方法精密度与专属性及回收率均符合方法学要求。通过单因素优化及响应面优化法,得到脂质体的较优处方,在该处方下制备得到的AMLs Size为(75.95±0.78)nm,PDI为0.30±0.02,粒径分布较为均匀,Zeta电位为(-21.63±1.59)m V,其绝对值较高,所测得的AMLs包封率为(80±0.03)%,制备的纳米脂质体混悬液显淡蓝色乳光。红外图谱中,AMLs冻干粉末在1720 cm~(-1)有羰基上N-H基团的伸缩振动峰,在2928 cm~(-1)处有酰胺键上N-H的伸缩振动峰,另有m PEG-PLGA、大豆磷脂、胆固醇特征峰,无新的峰形出现,显示脂质体成功制备。在稀释稳定性考察中,将AMLs在室温下利用超纯水稀释数倍后,测定其Size与PDI的变化,发现未发生较大改变,表明其具有较好的稀释稳定性;在血清稳定性试验中,将AMLs与胎牛血清共孵育24 h,于不同时间点测定混悬液吸光度,发现其未发生显著变化,表明AMLs具有较好的血清稳定性;将AMLs在4℃在储存,于第1、3、5、7、9天测定其Size与PDI,发现其未发生显著变化,表明AMLs具有较好的储存稳定性;在体外释放试验中,发现与AS-3-MA溶液相比,AMLs在48 h有44.59%释放,而AS-3-MA溶液则释放了接近75%,表明AMLs有缓慢释药的特性。4.肝素修饰的双氢青蒿素-3-甲基腺嘌呤前药纳米脂质体的制备及制剂学考察通过静电吸附作用制备得到肝素修饰的双氢青蒿素-3-甲基腺嘌呤前药纳米脂质体HAMLs,其Size为(86.95±0.40)nm,电位为(-24.60±0.25)m V,PDI为0.29±0.00,所制备的纳米脂质体具有较大的电位绝对值,较小的PDI,呈现淡蓝色乳光,透亮均一;对处方中的胆碱衍EPZ-6438生物与肝素钠比例进行优化,得到较优处方测得粒径为(82.00±0.89)nm,Zeta电位为(-24.00±0.55)m V。在100倍的稀释范围内内,经超纯水稀释后,HAMLs Size与PDI未发生显著变化,表明其具有较好的稀释稳定性;将HAMLs与胎牛血清共孵育24 h,其吸光度未发生显著变化,表明该纳米脂质体在血清中具有较好的物理稳定性;考察HAMLs在4℃环境下储存9天内稳定性,其粒径与PDI未发生显著变化,具有较好的储存稳定性;不同浓度的HAMLs与红细胞悬浮液进行孵育离心后,HAMLs均没有表现出明显的溶血现象,通过紫外分光光度仪测定吸光度,各浓度下HAMLs溶血率均小于5%,说明HAMLs具有较好的血液相容性和安全性。5.肝素修饰的双氢青蒿素-3-甲基腺嘌呤纳米脂质体的体外靶向性、抗吞噬及长循环考察两种荧光纳米脂质体C6Ls与HC6Ls外观均一透明,带有浅黄绿色荧光,C6Ls Size为(83.52±0.82)nm,PDI为0.27±0.04;HC6Ls Size为(92.22±2.23)nm,PDI为0.26±0.01,两种纳米脂质体的Zeta电位分别为(-25.33±1.19)m V、(-17.00±0.40)m V,两种脂质体的包封率分别为(86.LBH589研究购买03±1.03)%、(72.97±0.91)%。C6Ls与HC6Ls 9 h的累积释放率分别为(32.18±0.44)%、(23.90±0.26)%,两种纳米脂质体的累计释放率均小于35%,而C6溶液9 h内透过透析袋的累计释放率为(52.53±0.99)%,表明C6成功包封于纳米脂质体中,可以用于后续试验。高内涵成像系统考察HC6Ls的体外靶向性,结果显示,正常红细胞基本无C6信号,但是受感染的红细胞内可以观察较强荧光信号,说明经过肝素修饰的纳米脂质体具有对受感染的红细胞的靶向亲和作用。高内涵成像系统观察小鼠单核巨噬细胞RAW264.7对两种荧光纳米脂质体的摄取情况,结果显示,HC6Ls相较于C6Ls,巨噬细胞对其吞噬大大减少,表明肝素修饰的纳米脂质体可以有效逃逸其吞噬。对制备的HC6Ls进行体内长循环考察,得到HC6Ls在正常C57小鼠体内半衰期为(36.71±2.97)h,高于C6Ls,表明肝素修饰后的纳米脂质体较未经修饰的纳米脂质体具有长循环作用。6.肝素修饰的纳米脂质体的抗疟药效在伯氏疟原虫K173抗性虫株构建的动物模型中,各治疗组中,均观察到疟鼠的感染率呈现出随着给药剂量增加而降低的趋势。在相同剂量下,HAMLs组疟鼠感染率均要低于AMLs组以及AS-3-MA溶液组。以停药第4天的感染率,测得AMLs与HAMLs的ED_(50)值分别为:(1.69±0.22)μmol/kg,(1.06±0.12)μmol/kg,低于DHA单独给药的ED_(50)值:(2.71±0.06)μmol/kg。通过后续小鼠生存状况考察,发现同等剂量下HAMLs治疗的小鼠存活天数普遍多于AMLs组与AS-3-MA组,在第30天的观察期,AMLs最高剂量组疟鼠存活1/2,HAMLs最高剂量组疟鼠全都存活,但是鼠体质均已特别弱,表明HAMLs具有较好的抗疟效果。停药第15天,取正常鼠、疟鼠、DHA溶液组、AMLs组及HAMLs组小鼠肝、脾、肺、肾石蜡包埋切片并进行H&E染色病理分析,发现由于取材时间较晚,各治疗组鼠均可看到有病理损伤,疟色素沉积、炎症细胞浸润等,相比其他组,HAMLs组病理损伤较轻,总体来看,其在体内应用是安全的。结论:1.DHA与3-MA协同作用评价利用构建的伯氏疟原虫K173抗性虫株疟鼠模型,在单独给药得到各自ED_(50)基础上,设置剂量,采用两种方式给药,以停药第一天的感染率计算得到二者联合给药协同作用指数,发现CI均小于1,二者表现出协同作用。2.AS-3-MA的合成通过酰胺化反应合成AS-3-MA,并通过FT-IR、HR-MS、~1H-NMR、~(13)C-NMR多种手段对结构进行确证,显示成功合成了该前药。3.肝素修饰的双氢青蒿素-3-甲基腺嘌呤前药纳米脂质体的制备及质量表征肝素修饰的双氢青蒿素-3-甲基腺嘌呤前药纳米脂质体呈球形,粒径均匀,无团聚现象,具有较好的稀释稳定性,与胎牛血清(37±0.5)℃孵育24 h,吸光度未发生明显变化,表明其在血清中具有较好的物理稳定性;在4℃环境下9天的储存时间内,其粒径与PDI未发生显著变化,表明其具有较好的初步储存稳定性体外释放实验中,观察到缓释特性,体外溶血实验中未观察或者检测到溶血现象,符合试验要求。4.肝素修饰的纳米脂质体的体外靶向性、抗吞噬及长循环考察肝素修饰的纳米脂质体可以逃逸巨噬细胞的吞噬,逃避机体免疫系统清除,具有抗吞噬特性;肝素修饰的荧光纳米脂质体较未经修饰的纳米脂质体在体内具有更长的表观消除半衰期,在体内滞留时间更久,具有长循环的特性;另外,肝素修饰的纳米脂质体对受感染的红细胞具有较好的亲和靶向作用,可以实现药物的靶向递送。5.肝素修饰的纳米脂质体的抗疟药效在构建的伯氏K173抗性虫株动物模型中,在同等剂量下,与AS-3-MA溶液组及AMLs组相比,停药第四天HAMLs组疟鼠感染率均低于AS-3-MA溶液组及AMLs组,在第30天的观察期,AMLs最高剂量组疟鼠存活1/2,HAMLs最高剂量组疟鼠全都存活,总之,HAMLs的抗疟活性优于AMLs与AS-3-MA溶液,H&E染色病理分析发现HAMLs组疟鼠病理损伤较其他组轻,总体来看HAMLs在体内应用是安全的。

目的:观察健脾活血方对脾虚血瘀型慢性萎缩性胃炎(Chronic atrophic gastritis,CAG)癌前病变临床症候、胃镜及病理积分的疗效。应用1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(Methylnitronitrosoguanidine,MNNG)致人胃黏膜上皮细胞(Human Gastric mucosal Epithelial Cells,GES-1)恶性转化,建立胃癌前病变(Precancerous lesion of gastric cancer,PLGC)细胞模型(MC细胞),并通过全转录组测序技术检测健脾活血方干预前后MC细胞mRNAs及lncRNAs的表达差异,探讨健脾活血方治疗CAG癌前病变可能的作用机制。方法:1.临床研究收集2019年04月至2022年6月就诊于江苏省中医院普内科门诊及病房,符合脾虚血瘀型CAG癌前病变的患者共92例,通过数字随机法将患者分为试验组和对照组,试验组脱落3例,最终病例数为43例,对照组脱落5例,最终病例数为41。试验组予健脾活血方(黄芪15g、炒白术10g、炒苡仁15g、莪术10g、炒枳壳10g、佛手10g、鸡内金10g、石见穿15g等,由江苏省中医院中药房提供),每日1剂,水煎2次,每次200ml,早晚饭后1小时服用。对照组予口服叶酸片5mg(常州制药厂有限公司批号:H32023302),每日3次,每次1片,疗程均为12周。观察两组患者治疗前后的临床症候、胃镜及病理积分变化,进行统计学分析。2.实验研究2.1健脾活血方对MNNG致GES-1恶性转化细胞(MC细胞)生长、迁移及侵袭的体外抑制作用首先,设立人胃黏膜上皮细胞GES-1细胞为空白对照,以MTT法检测MNNG、健脾活血方及叶酸对GES-1细胞的活力影响,筛选出适合的干预浓度及干预时间。应用MNNG致GES-1细胞恶性转化,构建PLGC细胞模型(MC细胞)。使用健脾活血方水提液及叶酸溶液对MC细胞进行分组干预:第一组:GES-1+MNNG(MC细胞);第二组:GES-1+MNNG+健脾活血方低浓度(L);第三组:GES-1+MNNG+健脾活血方中浓度(M);第四组:GES-1+MNNG+健脾活血方高浓度(H);第五组GES-1+MNNG+叶酸。通过MTT检测、细胞划痕实验、Transwell侵袭实验分别观察不同浓度健脾活血方对MC细胞活力、迁移、侵袭能力的干预作用,并在光镜下观察对MC细胞形态的影响。2.2健脾活血方在MC细胞中的转录组学研究使用健脾活血方对MC细胞进行干预,对样本细胞进行RNA提取、纯化、文库构建和质检。运用全转录组测序技术检测经健脾活血方干预前后MC细胞的mRNAs和lncRNAs的表达差异并进行GO富集分析及KEGG富集分析,寻找健脾活血方可能调节的信号通路,为后续细胞实验提供依据。2.3健脾活血方通过TGF-β 1/Smad3/CTGF信号轴抑制MC细胞EMT的机制研究2.3.1 TGF-β 1激动剂对MC细胞生长、迁移、侵袭的影响及健脾活血方的干预作用通过MTT检测、细胞划痕实验、Transwell侵袭实验观察健脾活血方对TGF-β 1激动剂刺激后MC细胞活力、迁移、侵袭能力的干预作用,并在光镜下观察健脾活血方对TGF-β 1激动剂刺激后MC细胞形态的影响。具体分组:第一组:GES-1+MNNG(MC细胞);第二组:GES-1+MNNG+健脾活血方高浓度(H);第三组:GES-1+MNNG+TGF-β1激动剂;第四组:GES-1+MNNG+TGF-β 1激动剂+健脾活血方高浓度(H)。2.3.2健脾活血方对TGF-β 1/Smad3/CTGF信号轴及MC细胞的EMT抑制作用Western Blot 检测健脾活血方对 MC 细胞 TGF-β 1、Smad3、CTGF、E-cadherin、Vimentin蛋白表达的影响,并检测TGF-β 1激动剂刺激后MC细胞在健脾活血方干预前后各蛋白的表达情况。具体分组:第一组:GES-1+MNNG(MC细胞);第二组:GES-1+MNNG+健脾活血方低浓度(L);第三组:GES-1+MNNG+健脾活血方中浓度(M);第四组:GES-1+MNNG+健脾活血方高浓度(H);第五组GES-1+MNNG+叶酸;第六组:GES-1+MNNG+TGF-β 1激动剂;第七组:GES-1+MNNG+TGF-β 1激动剂+健脾活血方高浓度(H)。结果:1.临床研究1.1临床疗效比较试验组的总有效率为83.72%,对照组的总有效率为58.54%,试验组高于对照组,两组组间比较具有统计学意义(P<0.05)。1.2中医证候疗效比较试验组的总有效率为88.37%,对照组的总有效率为60.98%,试验组高于对照组,两组组间比较具有统计学意义(P<0.05)。1.3中医证候积分比较:两组中医证候总积分治疗后均下降,具有统计学意义(P<0.05),两组治疗后中医证候总积分组间比较,试验组低于对照组,具有统计学意义(P<0.05)。在中医证候各单项积分方面,两组治疗后胃脘隐痛、胃脘痞胀、食少纳呆、大便稀溏、倦怠乏力、气短懒言及食后脘闷等积分均下降(P<0.05),除大便稀溏外,其余中医证候各单项积分治疗后组间比较,试验组均低于对照组,具有统计学意义(P<0.05)。而两组治疗后大便稀溏积分组间比较无统计学意义(P>0.05)。1.4胃镜及病理疗效两组胃镜下胃黏膜积分治疗后均下降,具有统计学意义(P<0.05),两组治疗后胃黏膜积分组间比较,试验组低于对照组,具有统计学意义(P<0.05)。在组织病理学疗效上,两组治疗后胃黏膜萎缩、肠上皮化生、活动性及慢性炎症积分均下降(P<0.05),并且两组患者治疗后各项积分组间比较,试验组均低于对照组,具有统计学意义(P<0.05)。在异型增生方面,治疗后两组均有改善,但无统计学意义(P>0.05)。2.实验研究2.1健脾活血方对MC细胞生长、迁移及侵袭的体外抑制作用MTT检测显示:与空白组相比,各浓度的MNNG干预后GES-1细胞的活性显著下降,具有统计学意义(P<0.05)。随着MNNG浓度的增加,GES-1细胞的活性逐渐下降,呈浓度及时间依赖性。当MNNG浓度为40μmol/L时对GES-1细胞的抑制率约为20%。根据参考文献及预实验结果,设定后续实验MNNG干预浓度为40μmol/L,干预时间为48h;与空白组相比,各浓度健脾活血方及叶酸溶液干预后GES-1细胞的活性显著增加,具有统计学意义(P<0.05),并且随着浓度增加GES-1细胞活性逐渐增加,呈浓度依赖及Docetaxel纯度时间依赖。设定后续实验健脾活血方低、中、高干预浓度分别为4、8和16 mg/mL,干预时间均为48h。叶酸溶液的干预浓度为1μg/mL,干预时间为48h。正常的GES-1细胞在培养皿中附壁生长,细胞外形呈梭形,形态规则。加入MNNG干预后可见部分细胞死亡,说明MNNG具有细胞毒性。伴随干预时间增加,存活的细胞形态逐渐不规则,呈多角形,并且聚集生长,排列紧密错乱呈“岛样”,胞浆内见空泡,说明MC细胞造模成功。与GES-1+MNNG组(MC细胞)相比,各浓度的健脾活血方和叶酸溶液干预后MC细胞形态改善,周边毛刺状减少,多角形态减少,排列较前规则,死亡细胞数目逐渐减少,并且细胞活性、细胞迁移率及侵袭能力显著下降,具有统计学意义(P<0.05);与GES-1+MNNG+叶酸组相比,高浓度健脾活血方干预后MC细胞活性、迁移率及侵袭均显著下降,具有统计学意义(P<0.05)。2.2健脾活血方在MC细胞中的转录组学研究MC细胞经健脾活血方干预后检测出差异mRNAs共324个,上调mRNAs为172个,下调mRNAs为152个;差异lncRNAs共845个,上调lncRNAs为468个,下调lncRNAs为377个。差异的mRNAs通过KEGG富集分析富集到与CAG“炎-癌”转化密切相关的信号通路包括:PPAR信号通路、ErbB信号通路、Wnt信号通路、IL-17信号通路、EGFR信号通路、JAK-STAT信号通路、TNF信号通路、PI3K-Akt信号通路及TGFChild psychopathology-β信号通路。其中 TGF-β 1 信号通路中 ENSG00000125378 上调,而 ENSG00000136997、ENSG00000163235、ENSG00000281453 下调。2.3健脾活血方通过TGF-β 1/Smad3/CTGF信号轴抑制MC细胞EMT的机制研究2.3.1 TGF-β 1激动剂对MC细胞生长、迁移、侵袭的影响及健脾活血方的干预作用与GES-1+MNNG组(MC细胞)相比,经TGF-β 1激动剂干预后MC细胞的形态变得更加不规则,胞体变大,呈多角形,排列絮乱,“岛样”聚集生长增加,且细胞活性、迁移及侵袭显著增加,具有统计学意义(P<0.05);与GES-1+MNNG+TGF-β 1激动剂组相比,TGF-β 1激动剂刺激的MC细胞经健脾活血方干预后形态改善,细胞周边毛刺状减少,多角形态减少,排列较前规则,死亡细胞数目逐渐减少,排列较前有序,“岛样”聚集生长减少,且细胞活性、迁移及侵袭显著下降,具有统计学意义(P<0.05)。2.3.2健脾活血方对TGF-β 1/Smad3/CTGF信号轴及MC细胞EMT的抑制作用Western Blot检测显示:与GES-1+MNNG组(MC细胞)相比,各浓度的健脾活血方及叶酸溶液干预后MC细胞的TGF-β 1、Smad3、CTGF、Vimentin表达显著下降,E-cadherin水平显著升高,具有统计学意义(P<0.05);与GES-1+MNNG+叶酸组相比,高浓度健脾活血方干预后MC细胞的TGF-β 1、Smad3、CTGF、Vimentin蛋白表达水平显著下降,E-cadherin蛋白表达水平显著升高,具有统计学意义(P<0.05);与GES-1+MNNG组(MC细胞)相比,通过TGF-β 1激动剂干预后的MC细胞中TGF-β 1、Smad3、CTGF、Vimentin蛋白表达显著升高(P<0.05),而E-cadherin蛋白表达显著下降,具有统计学意义(P<0.05);与GES-1+MNNG+TGF-β 1激动剂组相比,TGF-β 1激动剂刺激后的MC细胞经高浓度健脾活血方干预后TGF-β 1、Smad3、CTGF、Vimentin蛋白表达显著下降(P<0.05),E-cadherin蛋白表达显著升高(P更多<0.05),具有统计学意义。结论:1.健脾活血方可以显著减轻脾虚血瘀型CAG癌前病变患者临床症状,改善患者胃镜下胃黏膜征象,逆转胃黏膜萎缩及肠上皮化生,对异型增生也有一定的抑制作用。2.全转录组测序显示PLGC细胞模型MC细胞经健脾活血方干预后差异mRNAs富集分析到的信号通路部分与CAG“炎-癌”转化密切相关,健脾活血方可能通过调节TGF-β1信号通路在本病中发挥治疗作用,为健脾活血方作用机制研究提供了方向。3.健脾活血方通过抑制TGF-β 1/Smad3/CTGF信号轴阻断MC细胞的EMT进程,阻止CAG“炎-癌”转化,这可能是其治疗CAG癌前病变的机制之一。