SRC信号通路

目的：分析右美托咪定与小剂量氯胺酮在小儿短小手术麻醉中应用效果。方法：选取佳木斯骨科医院72例行短小手术者，将患者按照住院号排序后取随机数字分为三组，各24例。其中右美托咪定组术前给予静脉滴注0.5μg/kg的右美托咪定(右美托咪定组),氯胺酮组静脉滴注0.5 mg/kg氯胺酮(氯胺酮组),对照组静脉滴注生理盐水5 ml(对照组),采用Malviya、Ramasy镇静程度评分法对患儿术后躁动情况评价，使用视觉模拟量表(VAS)对患儿术后3 h、5 h、8 h的疼痛度进行评估。结果：右美托咪定组患儿躁动出现率为4.17%,氯胺酮组为12.5Bone infection0%,对照组为33.33%,组间差异具有统计学意义(P<0.05),其中氯胺酮组和对照组躁动率高于右美托咪定组，对照组高于氯胺酮组，差异具有统计学意义(P<0.05);右美托咪定组患儿Ramasy镇静程度评分为(2.35±0.67)分，氯胺酮组为(1.14±0.51)分，对照组为(0.69±0.06)分，三组比较差异具有统计学意义(P<0.05);麻醉结束至VAS≥4分的时间和镇痛药使用至VAS<4分的时间比较，三Alpelisib抑制剂组间差异具有统计学意义(P<0.05),其中右美托咪定组麻醉结束至VAS≥4分的时间长于氯胺酮组和对照组，氯胺酮组长于对照组，右美托咪定组镇痛药使用至VAS<4分的时间短于氯胺酮组和对照组，氯胺酮组短于对照组时间，差异均具有统计学意义(P<0.05);三组患儿术后3 h、5 h、8 h VAS评分差异具有统计学意义(P<0.05),其中右美托咪定组患儿VAS评分均低于氯胺酮组和对照组相应评分selleck VE-822，氯胺酮组VAS评分低于对照组，差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论：行短小手术患儿联合小剂量氯胺酮或右美托咪定，可以有效降低患儿术后躁动，同时缓解患儿应用麻醉药后出现的痛觉过敏现象，有助于提高术后安全性。

目的多发性大动脉炎,又称Takayasu动脉炎(Takayasu’s Arteritis,TAK)是一种慢性进行性自身免疫性炎症疾病。TAK多发于亚洲青年女性,病变以原因不明的肉芽肿性血管炎为主,造成主动脉及其主要分支动脉管壁纤维化、管腔狭窄甚至闭塞;病变可累及全身任何器官,常呈多发性;临床表现因病变累及部位不同而各异,主要表现为相应器官的灌注异常导致的一系列临床症状和并发症,属于临床疑难杂症。然而,由于发病机制不清楚,TAK的临床治疗主要依靠糖皮质激素等非特异性免疫抑制剂,出现并发症只能依靠手术治疗避免疾病进程恶化,这种常规治疗方案并发症较多,达不到个体化治疗的效果,目前临床治疗缺乏靶向性的治疗策略。既往研究已经证明,免疫细胞,尤其是不同种类的T细胞在TAK的发病过程中发挥关键作用。在TAK患者中,受累及的动脉外膜经常被免疫细胞浸润,进而导致血管炎症和相应的器官损伤。辅助性T细胞(T helper cell,Th),包括Th1和Th17,是TAK累及动脉外膜层的主要浸润细胞。在大动脉炎患者的外周血中,Th1和Th17细胞的数量明显提升~([1])。同时,在我们既往实验中观察到,TAK患者T细胞存活时间显著延长,导致炎症反应持续时间延长。因此,分化和维持这种促炎性Th1和Th17细胞亚群的机制研究对于促进我们对TAK病因的理解和随后的治疗探索是相关的。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)通过协调真核细胞的生长、代谢、环境营养素和生长因子,在包括调节蛋白质合成以及自噬的许多基本细胞过程中发挥核心作用~([2-4])。m TOR分为m TORC1和m TORC2。我们既往研究发现,TAK患者CD4~+T细胞内m TORC1过度活跃,导致促炎性T细胞自发分化不良~([5])。使用雷帕霉素或RAPTOR sh RNA抑制m TORC1可消除TAK患者促炎性T细胞的不良分化~([5])。阻断m TORC1可以缓解人源化TAK嵌合小鼠中的人类血管炎症~([5])。因此,我们认为m TORC1过度活跃是TAK患者CD4~+T细胞的关键特征~([5])。然而,导致TAK患者中T细胞m TORC1过度活跃的机制尚不清楚。Notch是一种保守受体,控制包括免疫细胞在内的多种细胞类型的命运和功能~([6-9])。大量研究证据表明Notch信号在CD4~+T细胞分化和功能中起着重要作用~([1,6,10-12])。既往研究发现,在巨细胞动脉炎(Giant Cell Arteritis,GCA)患者中,CD4~+T细胞的Notch-1活性增加,导致促炎性T细胞分化~([6])。在高水平血管内皮生长因子的刺激下,GCA受影响动脉外膜中的微内皮细胞表达Jagged1,形成结构生态位,在接触CD4~+T细胞时诱导Notch-1活性~([6])。GCA患者T细胞的这种Notch-1高活性导致AKT/m TORC1激活,从而促进Th1和Th17细胞亚群的分化~([6])。因此,Notch信号可能是T细胞中m TORC1活性的主要调节器。同时,我们既往研究已经检测到TAK发病过程Notch-1信号异常增强,推测Notch-1可能是调节T细胞m TORC1活性,导致TAK患者促炎性T细胞分化异常的关键分子。腺苷酸活化蛋白激酶(Adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)是能量代谢和线粒体稳态的守护者,它可感知ATP不足和AMP/ATP比率增加,从而启动分解代谢和ATMRTX1133体外P生成。在α-亚基的Thr172部分磷酸化后,AMPK可以磷酸化TSC2和RAPTOR,达到抑制m TOR的激活和稳定性,导致m TOR失活的作用。既往研究表明,AMPK对于所有调节性T细胞的分化都非常关键。经过预实验,我们发现,TAK患者CD4~+T细胞中AMPK活性异常增高。因此,我们推测AMPK信号高表达可能与TAK患者T细胞生存时间延长存在联系。据此,在本次研究中,我们对TAK患者中Notch-1和AMPK两组信号通路活性进行研究,旨在明确TAK患者中T细胞异常活化和生存的机制,探寻临床治疗Takayasu动脉炎的新策略。方法为了明确TAK患者T细胞分化与功能异常的具体机制,我们选取2020年1月至2021年12月,于吉林大学第一医院就诊的TAK患者50名,选取50名年龄、性别匹配的健康对照。同时,招募10名患有肉芽肿性血管炎的患者作为疾病对照,进行了以下实验:第一章、T细胞在TAK患者中的分化与存活特性。1、TAK患者T细胞分化实验:(1)为了确定TAK患者中的CD4~+T细胞是否存在促炎性T细胞亚群分化异常,我们将TAK患者和健康对照的CD4~+T细胞用抗CD3/CD28珠激活后,流式检测Th1和Th17亚群分化情况。(2)为了明确TAK患者CD4~+T细胞内高分化的促炎性T细胞亚群是否具有生物活性,我们检测Th1和Th17细胞亚群的转录因子T-bet和ROR-γ的表达情况。2、TAK患者T细胞存活能力实验:为了明确TAK患者T细胞存活能力,我们使用Annexin V/7-AAD凋零检测试剂盒比较TAK患者和健康对照的激活后的CD4~+T细胞凋亡结果。第二章、TAK患者T细胞分化异常的分子机制。1、TAK患者T细胞中Notch-1活性实验:为了检测TAK患者的促炎性T细胞分化中的Notch-1信号是否存在异常表达,我们分析TAK患者,GPA患者和健康对照CD4~+T细胞内Notch-1和激活Notch-1的表达产物以及与促炎性T细胞之间的关系。2、TAK患者T细胞中Notch-1与促炎性T细胞分化关系实验:(1)为明确Notch-1与促炎性T细胞异常分化之间关系,我们分析TAK患者CD4~+T细胞中激活Notch-1与促炎性T细胞之间的关系。(2)为了进一步证明Notch-1信号与促炎性T细胞分化的关系,我们应用Notch-1胞内结构域(NICD)处理健康CD4~+T细胞,观察促炎性T细胞的分化情况。同时我们敲除TAK患者CD4~+T细胞的Notch-1基因,观察促炎性T细胞的分化情况。3、Notch-1调节促炎性T细胞分化的机制研究:(1)根据既往研究结果,我们假设,Notch-1可能通过调节m TORC1驱动促炎性T细胞分化。为证实该假设,我们应用NICD处理健康CD4~+T细胞,检测细胞内m TOR的m RNA水平、RAPTOR、RICTOR、m TOR、p-S6RP、S6RP、p-AKT和AKT的表达。我们敲除NICD处理的健康CD4~+T细胞中的RAPTOR基因,检测促炎性T细胞分化情况。我们再次敲除TAK患者CD4~+T细胞中的Notch-1基因,检测细胞内p-S6RP、S6RP、p-AKT和AKT的表达以及促炎性T细胞的分化情况。我们同时分析TAK患者的CD4~+T细胞,检测细胞内p-S6RP和激活Notch-1的关系。(2)为探究Notch-1与m TORC1的具体作用机制,我们检测TAK患者CD4~+T细胞中溶酶体m TOR的表达。同时我们应用NICD或DAPT处理健康CD4~+T细胞,检测溶酶体m TOR的表达。第三章、TAK患者T细胞存活异常的分子机制。1、为了明确TAK患者T细胞中AMPK的状态,我们比较TAK患者和健康对照的激活后的CD4~+T细胞中磷酸化AMPK水平、2、为了直接检测AMPK在TAK患者促炎性T细胞存活中的作用,我们在TAK患者CD4~+T细胞中加入复合物C,分析凋亡细胞数量。同时,我们敲除TAK患者CD4~+T细胞AMPK基因,以及应用AMPK激动剂A769662激活健康对照CD4~+T细胞内AMPK,分析T细胞凋亡数量。3、为了明确AMPK延长T细胞生存的具体机制,我们应用seahorse细胞能量代谢分析仪分析TAK患者和健康受试者的T细胞的线粒体耗氧率,同时应用复合物C抑制TAK患者T细胞中AMPK后,再次测定T细胞的线粒体耗氧率。同时,我们应用丙二酸抑制TAK患者T细胞内线粒体三羧酸循环,检测细胞凋亡数量。再同时应用A769662和丙二酸处理TAK患者T细胞后,检测细胞凋亡数量。4、为了探讨TAK患者T细胞中AMPK过度激活的临床相关性,我们分析了TAK临床患者CD4~+T细胞内磷酸化AMPK水平与TAK患者的红细胞沉降率和C反应蛋白的相关性。5、为了探讨AMPK活性异常的分子机制,我们应用DAPT处理TAK患者CD4~+T细胞后,观察细胞内磷酸化AMPK的水平。再应用Notch sh RNA转染TAK患者CD4~+T细胞后,分析细胞内p-AMPKα的表达,同时分析凋亡细胞数量。第四章、基于人源化TAK疾病模型的转化研究。1、原创性构建人源化TAK疾病模型;2、明确Notch-1与人源化TAK疾病模型中促炎性T细胞异常分化之间的关系;3、利用人源化TAK模型对Notch信号进行靶向调控,明确转化价值。结果第一章、T细胞在TAK患者中的分化与存活特性。1、TAK患者T细胞存在自发性促炎性Th1和Th17亚群分化异常:(1)在TAK患者的CD4~+T细胞中,Th1亚群和Th17亚群分化频率较高。(2)与来自健康对照组外周血的CD4~+T细胞相比,TAK患者的CD4~+T细胞表现出转录因子T-bet和ROR-γ的高表达。以上结果证实,TAK患者T细胞内存在Th1和Th17亚群的异常分化。2、TAK患者T细胞存活能力增强:相比健康对照组,TAK患者T细胞凋亡更少。证明TAK患者T细胞的存活能力更强。以上结果证明,TAK患者T细胞的分化和存活能力均异常增强。第二章、TAK患者T细胞分化异常的分子机制。1、TAK患者T细胞中Notch-1活性实验:相比健康对照和GPA患者,TAK患者CD4~+T细胞中Notch-1和激活Notch-1表达更高。相比健康对照,TAK患者CD4~+T细胞中Notch-1的表达水平明显增加。这些结果说明TAK患者中的CD4+T细胞存在Notch-1高表达。2、TAK患者T细胞中Notch-1通路与促炎性T细胞分化关系实验:我们证明,TAK患者CD4~+T细胞内激活Notch-1表达频率与Th1和Th17细胞亚群的分化频率呈正相关。应用NICD处理可以增加TAK患者Th1与Th17细胞亚群分化频率,同时增加T-bet和ROR-γ的表达。使用sh RN购买BMN 673A策略敲除Notch-1基因后,Notch-1的表达被明显抑制,同时Th1与Th17细胞亚群分化被抑制。这些结果说明Notch-1信号调节TAK患者的促炎性T细胞分化。3、Notch-1调节促炎性T细胞分化的机制研究:(1)实验结果显示,通过转染NICD导致的健康CD4~+T细胞中Notch-1高表达,可导致m TOR蛋白表达增加约2-3倍,转染NICD后CD4~+T细胞中m TOR的m RNA水平明显增加。Notch-1高表达增强了RAPTOR的表达,然而RICTOR的表达不受影响。转染NICD的CD4~+T细胞内p-S6RP水平显著升高,p-AKT水平变化无统计学意义。敲除m TORC1的基因,同样可以阻碍Notch-1高表达诱导的促炎性T细胞分化。敲除Notch-1的基因可以有效降低p-S6RP表达水平,而p-AKT表达水平不受影响。在TAK患者的CD4~+T细胞中,细胞内激活Notch-1与p-S6RP呈正相关。结合实验结果,我们证明Notch-1通过调节m TORC1驱动促炎性T细胞分化。(2)实验结果表明,与对照组相比,TAK患者CD4~+T细胞中溶酶体m TOR的表达增加。用NICD转染健康CD4~+T细胞可以导致溶酶体m TOR的表达增加。DAPT通过抑制Notch活性,导致CD4~+T细胞中溶酶体m TOR表达减少。这表明Notch-1通过调节TAK患者T细胞中溶酶体m TOR的表达,调节m TORC1的活性。以上结果证明,TAK患者CD4~+T细胞中存在Notch-1高表达,Notch-1通过调节TAK患者m TORC1活性,调节促炎性T细胞异常分化。第三章、TAK患者T细胞存活异常的分子机制。1、我们发现,TAK患者T细胞中磷酸化AMPK水平明显升高。2、实验结果表明,应用AMPK抑制剂复合物C可以抑制TAK患者T细胞的存活。敲除AMPK基因可影响AMPK的表达,导致TAK患者T细胞凋亡数量增多。激活AMPK可提高健康对照T细胞的存活率。这些结果说明TAK患者T细胞的生存需要AMPK激活。3、应用Seahorse细胞能量代谢分析仪分析结果显示,TAK患者T细胞的线粒体OCR明显增高,表现为基础OCR增高,最大呼吸能力增强。在TAK患者T细胞培养基中加入复合物C,观察到线粒体OCR升高趋势被抑制。三羧酸循环抑制剂丙二酸可以导致T细胞凋亡数量明显增加。在存在AMPK激动剂A769662的情况下,丙二酸仍可以导致T细胞的凋亡数量增加。这些结果说明AMPK通过影响T细胞线粒体代谢达到naïve and primed embryonic stem cells延长T细胞生存时间的结果。4、TAK患者T细胞内磷酸化AMPK水平与同一患者的红细胞沉降率和C反应蛋白水平呈正相关。说明T细胞中的AMPK活性与TAK患者的疾病活动性呈正相关。5、Notch-1可以调节TAK患者T细胞AMPK活性:DAPT显著降低了TAK患者T细胞中磷酸化AMPK水平。敲除Notch-1基因可以降低AMPK活性和促炎性T细胞存活率。这些结果说明Notch-1可以调节TAK患者T细胞AMPK活性。以上结果证实,AMPK过度激活导致TAK患者T细胞存活延长,同时Notch-1信号在T细胞AMPK活性调节中起到重要作用。第四章、基于人源化TAK疾病模型的转化研究。1.在既往研究的基础上,我们再次成功原创性构建人源化TAK疾病模型。2.我们证实,Notch-1信号调节人源化TAK疾病模型促炎性T细胞分化。3.我们证实,在人源化TAK疾病模型中靶向Notch-1治疗,可以抑制促炎性T细胞分化,减轻人类动脉移植物的炎症反应。体内实验结果表明,靶向Notch-1是治疗TAK的一种有前途的治疗策略。结论我们证明,TAK患者T细胞存在促炎性Th1和Th17亚群分化和存活异常。Notch-1通过调节m TORC1激活促炎性T细胞分化,AMPK活性上调是TAK患者T细胞存活延长的基础。Notch-1信号可以调控TAK患者T细胞AMPK活性的作用。体内实验证明,靶向Notch-1可有效缓解人源化TAK嵌合小鼠中的血管炎症。该研究为靶向Notch-1在TAK的临床治疗方面提供了更多理论依据,为TAK的精准治疗提出了新颖且有前景的策略。

目的:分析儿童大疱性系统性红斑狼疮的临床特点。Q-VD-Oph分子式方法:回顾性分析3例儿童大疱性系统性红斑狼疮资料，并总结文献报道的15例病例临床特点及治疗转归。结果:18例患儿中皮肤和肾脏病理资料完整者更多16例，平均年龄11.22岁，男女比例为2∶16;10例以皮肤大疱首发，12例大疱发生在狼疮肾炎之前；12例合并发热、9例合并口腔溃疡，14例出现贫血。所有病例ANA阳性，13例存在3种及以上血清自身抗体。皮肤病理特点为基底膜补体及免疫球蛋白沉积，10例24 h尿蛋白≥1.5 g; 16例患儿具有肾脏病理资料，其中Ⅴ型狼疮肾炎7例、Ⅳ型狼疮肾炎6例、Ⅲ型狼疮肾炎3例。氨苯砜对皮损有效，免疫抑制剂可减少大疱复发，利妥昔单抗和贝利尤单抗治疗对于难治性患儿可能有效。结论:多系统性受累、多种自身抗体阳性和狼疮肾炎是儿童大疱性系bacterial symbionts统性红斑狼疮的特点，免疫抑制治疗可改善预后，抗B细胞治疗可作为难治性病例的选择。

目的 通过多个数据库资料结合临床样本分析喉鳞状细胞癌(鳞癌)患者中肿瘤坏死因子受体超家族成员(TNFRSF)4表达水平的变化，研究TNFRSF4在喉鳞癌发生发展中的作用。方法 根据高通量基因表达(GEO)数据库和癌症基因组图谱(TCGA)数据库转录组表达谱数据筛选出差异表达的基因，结合基因表达谱数据PLX5622体外动态分析(GEPIA)数据库对差异基因TNFRSF4进行表达水平预测和生存分析；同时通过3例患者的喉鳞癌组织与癌旁组织标本进行qRT-PCR和Western blot验证，基于TCGA的临床数据PS-341作用绘制K-M生存曲线图并进行Cox回归分析。采用基因集富集分析探究与TNFRSF4在喉鳞癌中作用有关的信号通路。结果 数据库和临床样本中，喉鳞癌组中TNFRSF4的表达高于正常组(P<0.05),且TNFRSF4高表达组的生存率高于TNFRSF4低表达组(P<0.01)。多因素的Cox回归分析显示，TNFRSF4表达水平(HR:0.430,95%CPostmortem toxicologyI:0.229～0.806,P=0.009)、性别(HR:0.424,95%CI:0.204～0.882,P=0.022)、淋巴结分期(HR:2.010, 95%CI:1.055～3.831,P=0.034)和远处转移(HR:3.706, 95%CI:1.152～11.922,P=0.028)四个因素共同对患者的总生存时间产生影响。基因集富集分析的结果显示，与TNFRSF4表达最显著相关的信号通路有细胞黏附分子、JAK-STAT信号通路、T细胞受体信号通路、B细胞受体信号通路、原发性免疫缺陷和自身免疫性甲状腺疾病。结论 TNFRSF4高表达可能是喉鳞癌患者预后良好的生物标志物。

目的 探讨龙胆苦苷（GPS）对单侧输尿管梗阻（UUO）小鼠肾间质纤维化的改善作用及其机制。方法将25只C57BL/6雄性小鼠随机分为假手术组、模型对照组、GPS低剂量组、GPS高剂量组、厄贝沙坦组，每组各5只。假手术组正常饲养，其余四组采用结扎单侧输尿管的方式建立UUO模型。造模成功后，GPS低、高剂量组分别给予0.1、0.2 g/kg GPS腹腔注射，厄贝沙坦组给予0.GSK12602 g/kg厄贝沙坦腹腔注射，模型组和假手术组给予等体积生理盐水腹腔注射，连续7 d。处死小鼠，取肾脏组织，采用HE染色法观察肾组织形态学变化，Masson染色法观察肾组织纤维化情况，采用Western blotting法、RT-qPCR法检测肾组织纤连蛋白（Fn）、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）蛋白及mRNA表达。另取6只小鼠，随机分为模型组和干预组各3只，建立UUO模型后，干预组给予0.2 g/kg GPS腹腔注射，模型组给予等体积生理盐水腹腔注射，连续7 d。处死小鼠，取肾脏组织进行转录组测序，分析两组差异表达基因，并进行GO和KEGG通路富集，最后采用RT-qPCR法进行验证。结果 与假手术组比较，模型对照组肾小管明显扩张，肾组织大量炎性细胞浸润，肾间质大量胶原纤维沉积；与模型对照组比较，GPS低、高剂量组肾脏组织肾小管扩张、炎性细胞浸润有一定程度减轻，肾间质纤维化改善，其中GPS高剂量组改善效果更明显。与假手术组比较，模型对照组肾脏组织Fn、α-SMA蛋白及mRNA表达水平均升高；与模型对照组比较，GPS低、高剂量组肾脏组织Fn、α-SMA蛋白及mRAZD2281纯度NA表达水平均降低，且GPS高剂量组低于低剂量组（P均<0.05）。测序分析结果显示，模型组与干预组存在710个差异表达基因。GO富集分析显示，差异表达基因主要集中在细胞进程、生物调节、生物进程调控等方面；KEGG通路富集分析发现，差异表达基因涉及Ras、Rap1、PI3K/AKT、MAPK信号通路等。筛选出2个有效基因HGF、CCDC3进行验证，干预组肾组织HGF、CCDC3表达水平较模型组升高（Pmedial elbow均<0.05），与测序结果一致。结论 GPS能够有效改善UUO小鼠肾脏纤维化，且高剂量GPS改善作用更明显；其作用机制可能与上调HGF及CCDC3表达作用于Rap1、Ras、PI3K/AKT、MAPK信号通路等生物学途径有关。

【目的】为‘冬枣’果实的采后品质维持及市场销售提供参考。【方法】以初红期大荔‘冬枣’果实为试材，室温贮藏9 Imidazole ketone erastin体内d，分别于贮藏1、3、5、7、9 d时取样，通过测定生理指标和代谢组，探究‘冬枣’果实采后不同贮藏期的生理代谢特征。【结果】‘冬枣’果实采后呼吸速率下降，且无呼吸高峰出现，符合非跃变型呼吸生理特征。室温条件下‘冬枣’果实失重率高，贮藏9 d时失重率达到9%，果皮快速转红且开始出现皱缩现象。抗氧化酶SOD活性、CAT活性在贮藏1～7 d时保持较高水平，贮藏7 d后下降。‘冬枣’果实采后贮藏过程中，果糖、葡萄糖、琥BAY 73-4506珀酸、柠檬酸、维生素C的含量降低，导致果实口感变差，营养成分减少；表儿茶素是含量最丰富的类黄酮类物质，在贮藏过程中其含量显著下降，贮藏1 d时的含量是贮藏9 d时的3.23倍；其他大部分类黄酮在贮藏5 d时含量最高，贮藏5 d后含量下降，表明贮藏5 d后‘冬枣’果实抗氧化能力下降severe combined immunodeficiency。【结论】通过了解‘冬枣’采后室温贮藏条件下主要营养成分和果实特征变化，构建‘冬枣’果实采后衰老的生理变化规律和代谢网络，明确了‘冬枣’果实采后室温下最佳自然货架期为5～7 d。

NF-kB信号通路作为CIRI的中心环节，调控着CIRI过程中神经细胞的炎性反应并作为凋亡信号影响着CIRI的预后，而miRNA也是CIRI神经细胞凋亡信号中的重要调控因子。本文通过汇总NF-κB信号通路及miRNA介导的细胞凋亡机制发现两者有着相交、相似的调控模式，一些独特的NF-κimpulsivity psychopathologyB依赖性miRNA、miRNA激活性的NF-κB可能组成CIRI中独特的抗凋亡网络，发挥着巨大的抗神经细胞凋亡作用。针刺作为治疗CIRI的优选方法，不仅能够调Liproxstatin-1研究购买控miRNA的合成转录，也能诱导调控NF-κB信号通路。我们猜测，针刺参与调控CIRI中神经细胞凋亡信号可能与miRNA、NF-κB的交互作用有关。遂本文从NF-κB、miRNA的抗凋亡机制为出发点，汇NSC 119875分子式总了针刺调控相关信号的机制以及NF-κB、miRNA形成抗凋亡交互网络的研究进展，为研究针刺降低脑缺血再灌注损伤提供理论依据和新的研究方向。

目的 探讨甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)和甲状腺乳头状增生(papillary thyroid hyperplasia, PTH)中Dickkopf-1(DKK1)的表达及与上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)相关蛋白的关系。方法 采用生物信息学技术分析TCGA数据库中DKK1在PTC中的诊断价值；采用免疫组化EnVision法检测80例PTC和60例PTH组织中DKK1蛋白的表达，以及PTBaricitinib核磁C组织中MMP-2、E-cadherin和vimentin的表达，并分析其与临床病理特征及cytomegalovirus infection相关性。结果 生物信息学分析和免疫组化结果显示，DKK1对PTC诊断预测的曲线下面积(AUC)分别为0.674和0.874(P均<0.001),其确认细节灵敏度为95.0%,特异性为71.2%,诊断准确度为81.4%,误诊率为28.8%,漏诊率为5.0%,具有较高的诊断价值。PTC和PTH组织中DKK1的阳性率分别为28.8%(23/80)和95.0%(57/60),差异有统计学意义(P<0.001)。DKK1、MMP-2和E-cadherin表达与淋巴结转移相关(P<0.05),vimentin表达与淋巴结转移和患者年龄相关(P<0.05)。PTC组织中DKK1表达与E-cadherin表达呈正相关(r_s=0.272,P<0.05),与MMP-2、vimentin表达均呈负相关(r_s=-0.335、-0.336,P均<0.05)。结论 DKK1可作为辅助PTC和PTH鉴别诊断的重要标志物；DKK1可能参与PTC的EMT过程，可作为预测PTC侵袭和淋巴结转移的潜在标志物。

研究背景:急性肾损伤(Acute kidney injury,AKI)是一种以肾功能急剧下降为特征的临床危重症,主要表现为近端小管损伤以及血清肌酐和尿素氮水平升高,具有较高的发病率和死亡率。临床大数据随访研究发现,19%～31%AKI患者逐渐演变为慢性肾脏病(CKD,Chronic kidney disease),最终进展至尿毒症状态。尽管开展了大量的AKI研究,但AKI发生发展的内在机制尚未完全阐明,临床也缺乏治疗手段干预AKI向CKD转变,这是临床AKI救治面临的重大难题之一。大量的证据表明,肾小管损伤是AKI的典型特征,而肾小管损伤修复不良是AKI向CKD转变的主要诱发因素。据文献报道及我们课题组的研究发现,AKI中肾小管上皮细胞损伤的主要机制包括缺氧、细胞周期阻滞、持续氧化应激、焦亡、线粒体失能等。值得注意的是,急性肾小管缺氧是缺血再灌注损伤(Ischemia reperfusion injury,IRI)诱导AKI的典型特征。最近的研究表明,铁死亡作为一种新近发现的死亡方式参与了AKI的发生与发展。铁死亡是一种铁依赖性的细胞死亡,主要表现为铁离子蓄积、脂质活性氧增多、铁死亡抗氧化系统失调和线粒体损伤。有研究发现,敲除谷胱甘肽过氧化物酶(glutathion peroxidase 4,GPX4)能诱导小鼠出现AKI的特征,而敲除铁死亡的另一标志物长链脂肪酸辅酶a连接酶4(Long-chain-fatty-acid—Co A ligase 4,ACSL4)能缓解AKI,而且新近研究发现铁死亡抑制剂(如Ferrostatin-1和Lipostatin-1)可预防AKI,但是铁死亡在AKI中的致病机制仍未完全阐明。阻遏因子1沉默转录因子(Repressor element 1-silencing transcription factor,REST)是一种转录抑制因子,通过结合到靶基因的启动子区调节染色质结构或抑制基础转录对靶基因进行调控。早期的研究显示REST参与神经分化以及神经发育的调控,近年来,REST展现出越来越多的生物学功能,且具有细胞特异性。据报道,REST是缺氧时基因表达抑制的主要调节因子,可抑制20%的缺氧相关基因,这提示REST可能在AKI中发挥重要作用。最新的研究报道了REST参与脑IRI的病理过程,但其在IRI诱导AKI中的作用和机制尚不清楚。本研究以肾小管上皮细胞REST特异性敲除小鼠以及原代肾小管上皮细胞为研究对象、采用缺氧复氧(Hypoxia and reoxygenation,HR)损伤下敲低REST的转录组测序、透射电镜、流式检测ROS等方法,首先明确了REST在各种AKI模型中的表达上调,且基因敲除模型证实敲除REST能显著缓解AKI及其向CKD进展。随后,转录组测序以及相关功能实验发现,敲低肾小管上皮细胞REST能通过缓解铁死亡而减轻HR损伤。机制研究表明,REST通过转录调控谷氨酸胱氨酸连接酶修饰亚基(Glutamic cystine ligase modified subunit,GCLM)促进谷胱甘肽(Glutathione,GSH)生成缓解铁死亡。最后,我们利用基因敲除小鼠模型证实了敲除REST不但缓解IRI诱导的肾损伤,还可以延缓AKI向CKD的进展。因此,本研究揭示了REST的新功能及其作用机制。研究目的:探讨肾小管上皮细胞特异性敲除REST通过抑制铁死亡从而缓解AKI的作用和机制,明确靶向干预REST/GCLM/GSH信号通路对铁死亡及AKI向CKD转化的治疗效果。研究方法:1.体外研究(1)在人肾小管上皮细胞(HK-2),小鼠原代肾小管上皮细胞(Renal tubular epithelial cells,RTECs),大鼠肾小管上皮细胞(NRK52E)建立HR模型以及顺铂毒性模型,通过Western blot评估REST的表达水平改变。(2)通过si RNA敲低REST在HK-2细胞的表达并暴露在HR损伤下,采用q PCR、转录组测序、Western blot、PI/Calcein-AM染色、乳酸脱氢酶(Lactic dehydrogenase,LDH)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、GSH、谷氨酸胱氨酸连接酶(Glutamic cystine ligase,GCL)、活性氧(Reactive oxygen species,ROS)、脂质ROS以及透射电镜检测等方法确定敲低REST对铁死亡的作用。采用铁死亡诱导剂Erastin和RSL3处理细胞后评估铁死亡相关指标,验证敲低REST对铁死亡的抑制作用。selleck产品采用铁死亡抑制剂Ferrostatin-1以及DFO处理细胞后检测铁死亡相关的指标,探究敲低REST与铁死亡抑制剂的协同作用。(3)通过从REST~(flox/flox)小鼠提取原代肾小管上皮细胞并感染含有Cre酶的腺病毒以敲除REST,在此基础上干扰GCLM并诱导HR损伤,采用q PCR、Western blot、MDA、GSH、GCL、脂质ROS以及透射电镜等方法以探究REST/GCLM轴的干预对铁死亡的作用。此外通过双荧光素酶报告系统、结合位点点突变和免疫共沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation,Ch IP)探究REST对GCLM的转录调控。2.体内研究(1)分别通过IRI手术以及顺铂腹腔注射建立AKI模型,通过Western blot、免疫荧光等方法评估REST的表达水平。利用REST~(RTKO)小鼠建立IRI诱导的AKI模型,明确REST在肾小管上皮细胞的敲除对AKI中的作用,同时通过IRI手术即刻注射铁死亡抑制剂Ferrostatin-1,评估和REST~(RTKO)缓解AKI的协同效应。通过血清学检测肌酐以及尿素氮、q PCR实验、HE染色评估肾损伤程度。采用免疫荧光染色、Western blot评估REST的表达水平。(2)利用透射电镜技术观察肾小管上皮细胞的线粒体损伤、Western blot检测铁死亡相关蛋白表达、组织匀浆检测GSH、MDA、GCL活性等,探讨在肾小管上皮细胞敲除REST对AKI中铁死亡的影响。(3)在对照小鼠以及REST~(RTKO)小鼠建立IRI诱导的AKI to CKD模型,通过检测血清学指标肌酐、尿素氮,通过HE染色、MASSON染色、Western blot以及免疫组化评估纤维化程度以探究在肾小管上皮细胞敲除REST对AKI向CKD转化的影响。3.临床数据分析通过收集病理诊断为急性肾小管坏死(Acute tubular necrosis,ATN)肾活检标本以及肾肿瘤病人的癌旁组织行REST的免疫组化染色,并与血清肌酐、尿素氮相关性分析评估REST表达和肾损伤的关系。研究结果以及结论1.在AKI状态下,REST表达显著升高首先,在HK-2,NRK52E以及小鼠的原代肾小管上皮细胞中,HR处理和顺铂处理均能显著地诱导REST蛋白表达上调。其次,在IRI诱导的AKI小鼠模型和顺铂处理介导的AKI小鼠模型中,REST在m RNA和蛋白水平的表达均显著升高。最后,对临床肾活检AKI标本中,REST表达水平也显著升高,而且与血清肌酐、尿素氮水平均呈正相关。2.肾小管上皮细胞特异性敲除REST基因显著缓解IRI介导的AKI采用REST~(RTKO)小鼠以及REST~(flox/flox)小鼠建立IRI诱导的AKI模型,1天后取材检测肾损伤。通过肾组织HE染色、血清肌酐和尿素氮检测、q PCR检测肾组织中肾损伤相关标志物,发现在肾小管上皮细胞特异性敲除REST小鼠中,AKI显著缓解,肾功能得到明显恢复。这些结果提示REST上升加重AKI损伤。3.敲低REST表达能缓解HR损伤介导的肾小管上皮细胞铁死亡HK-2细胞敲低REST后经HR处理,PI/Calcein-AM染色、细胞活度以及LDH检测提示敲低REST显著缓解细胞死亡,转录组测序的结果提示敲低REST缓解HR损伤中的铁死亡。透射电镜观察到在HR组中,大量的线粒体固缩,密度增大,外膜破坏,线粒体嵴减少,呈现出显著的铁死亡特征,而REST干扰组显著改善这种线粒体破坏。此外,REST干扰组明显增加GSH生成水平,且减少MDA、ROS、以及脂质ROS的蓄积。为了进一步探索敲低REST对铁死亡的抑制作用,我们通过Erastin以及RSL3诱导HK-2中的铁死亡,LDH以及PI/Calcein-AM检测发现敲低REST显著缓解了RSL3诱导的铁死亡。为了探究REST的缺乏与铁死亡抑制剂的关系,我们在HK-2细胞中孵育铁死亡抑制剂Ferrostatin-1以及DFO并暴露在HR损伤下,GSH、MDA、脂质ROS检测发现敲低RESTY-27632浓度、Ferrostatin-1、DFO都显著缓解了HR损伤中的铁死亡,且敲低REST与Ferrostatin-1以及DFO存在协同作用。这些结果表明,REST能显著缓解HR模型介导的铁死亡。4.敲低REST通过上调GCLM缓解铁死亡为了探究REST调控铁死亡的机制,我们进一步通过q PCR检测了转录组测序中敲低REST后显著上调前10的基因,发现只有GCLM在体内以及体外均被敲低REST显著上调。通过小鼠原代肾小管上皮细胞中诱导REST敲除发现,在此基础上干扰GCLM使恢复的GCL活性、GSH、MDA、脂质ROS水平以及透射电镜下的线粒体损伤再次加重。这些结果提示REST缺乏可能通过促进GCLM表达使GSH生成增加从而抑制铁死亡。5.REST直接结合于GCLM基因启动子区抑制GCLM转录为了探究REST调控GCLM的机制,我们通过JASPR数据库预测了REST在GCLM启动子区域的结合位点,并根据结合位点设计了包含不同长度启动子区域的报告质粒。双荧光素酶报告系统以及Ch IP实验表明REST通过与GCLM启动子区域(-152～-132,gccgcaggccaagggccagtc)结合抑制GCLM的转录。6.肾小管上皮细胞特异性敲除REST缓解铁死亡及其介导的AKI,并延缓AKI向CKD转变采用特异性基因敲除小鼠,建立AKI模型并检测肾功能以及铁死亡相关指标。我们发现和对照小鼠相比,REST~(RTKO)小鼠中铁死亡被显著缓解。在此基础上,我们进一步采用铁死亡抑制剂Ferrostatin-1治疗AKI。肾功能检测、病理学染色、以及铁死亡相关指标的检测发现,REST的特异性敲除与Ferrostatin-1存在协同效应,但是Ferrostatin-1并不能恢复GCLMMedicopsis romeroi的表达水平,这进一步提示了敲除REST基因能提高GCLM表达增强GCL活性,恢复GSH生成的独特作用。由于AKI是CKD的独立风险因素,我们进一步探索肾小管敲除REST是否延缓AKI向CKD的转变。为此,采用REST肾小管上皮细胞敲除小鼠及其对照,建立了IRI诱导的AKI to CKD模型。HE染色、Masson染色、α-SMA以及Fibronectin的免疫组化表明,肾小管上皮敲除REST可显著恢复肾功能以及延缓纤维化进程,同时GCLM以及GPX4也被显著的缓解。这些结果表明肾小管上皮敲除REST可恢复GCLM的表达,从而缓解AKI且延缓AKI向CKD的进程。研究结论本研究中,我们进行了一系列体外和体内实验,证实REST在AKI损伤后表达上调,直接结合于GCLM基因启动子区而抑制其转录,导致GSH和GPX4下调,从而促进脂质过氧化和铁死亡,最终诱导AKI及其向CKD转化。而敲除肾小管上皮细胞的REST基因则能显著改善上述效应。本课题阐明了转录因子REST及其靶基因GCLM在铁死亡介导的AKI向CKD转化中的重要作用,提示REST及其介导的铁死亡有望成为AKI的潜在治疗靶点。意义本研究通过解析REST在AKI及其向CKD进展中的生物学作用,阐释了AKI的发病新机制,为临床AKI的治疗提供新线索。

目的:1、探讨CIRBP在血管内皮损伤后内膜增生中的作用;2、探讨CIRBP对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖和迁移的作用;3、明确CIRBP是否通过m TORC1途径调控VSMCs增殖和迁移。方法:本研究分为体外实验和体内实验两部分。1、FUT-175纯度体外实验:将小鼠血管平滑肌细胞分为阴性对照组和腺病毒干扰组,用完全培养基培养48小时后提取细胞总蛋白及RNA,通过western blotting以及PCLiproxstatin-1R实验检测血管平滑肌细胞中CIRBP的蛋白及m RNA表达情况;接着将血管平滑肌细胞分为Adv-NC、Adv-sh CIRBP和Adv-sh CIRBP+胰岛素组,通过western blotting实验检测m TORC1经典底物4Ebiomass liquefactionBP1和S6磷酸化水平;用Ki-67免疫荧光染色、CCK-8比色法检测细胞增殖能力,划痕实验检测细胞迁移能力。2、体内实验:将7周龄左右的C57BL/6J雄性小鼠适应性饲养一周后,白天光照12小时,按时喂予食物和水,将小鼠分为假手术组和颈动脉内皮损伤组,用粗糙导丝来回摩擦小鼠左颈总动脉血管内皮建立血管内皮损伤模型,假手术组不用导丝摩擦,其余手术过程同颈动脉内皮损伤组。术后观察小鼠状态,继续按时喂养食物和水,28天后按照分组进行血管取材,通过western blotting实验检测小鼠颈总动脉中CIRBP蛋白表达情况。为进一步探究CIRBP的作用,将小鼠分为假手术+Adv-NC组、假手术+Adv-sh CIRBP组、损伤内皮+Adv-NC组、损伤内皮+Adv-sh CIRBP组,首先在小鼠颈动脉损伤部位按照分组用干扰CIRBP腺病毒和阴性对照腺病毒孵育30分钟左右,假手术组中同样将上述腺病毒根据分组注射到左颈总动脉部位孵育相同时间,然后分别在术后第7、14、21天通过尾静脉追加注射相应的腺病毒1次,28天后进行血管取材,通过HE染色检测小鼠颈动脉内膜增生情况,免疫组化染色检测增生内膜细胞增殖情况。结果:与对照组相比,用腺病毒干扰血管平滑肌细胞后,CIRBP的蛋白及m RNA的表达均降低,干扰CIRBP之后,m TORC1的底物4EBP1和S6磷酸化水平降低,同时血管平滑肌细胞的增殖及迁移能力减弱;加入胰岛素恢复m TORC1活性后,干扰CIRBP对细胞增殖及迁移的抑制作用有逆转。小鼠颈动脉内皮损伤后,CIRBP的蛋白表达水平升高,血管内皮损伤后,内膜增生明显,与阴性对照组相比,在干扰CIRBP表达后,内皮损伤后内膜增生得到改善。结论:1、血管内皮损伤后增生内膜中CIRBP表达增加,干扰CIRBP后能抑制血管内膜增生;2、增殖期VSMCs中CIRBP表达增加,干扰CIRBP表达后抑制血管平滑肌细胞增殖和迁移;3、CIRBP可能通过正向调控m TORC1活性促进血管平滑肌细胞增殖及迁移能力。