鸡球虫病(coccidiosis)由艾美耳属鸡艾美耳球虫(Eimeria)感染引起。柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)是球虫种类中致病性最强的一种,主要寄生在鸡盲肠,可引起盲肠病变。鸡球虫病在世界各地均有发生,对养禽业造成的经济损失巨大。鸡球虫入侵宿主细胞是建立感染的第一步,防控鸡球虫病新型生物制品或药物的发现离不开对虫体入侵宿主细胞的Living donor right hemihepatectomy机制的深入探索。本课题组前期研究表明,鸡球虫子孢子特异性激活Ch TLR15/NFκB/NLRP3/IL-1β通路,提示Ch TLR15在球虫感染致肠道炎性损伤中作用重要。前期发现,乳酸菌可显著激活Nrf2抗氧化通路并下调IL-1β表达。氧化应激与炎症关系密切,推测Nrf2活化后可介导Nrf2抗氧化通路与Ch TLR15/Ch NLRP3串话,进而负向调控Ch TLR15炎症通路,从而减缓炎性损伤。特定种类的乳酸菌和植物来源的天然多酚具有调节Nrf2通路的活性。本研究选取前期实验证明可以激活Nrf2/HO-1通路的短乳杆菌23017(Lactobacillus brevis 23017)和多酚类化合物柯里拉京(Corilagin)作为Nrf2/HO-1通路激活剂,利用鸡成纤维传代细胞系(DF-1)建立了E.tenella子孢子体外感染模型,并应用RNAi技术探究了Nrf2/HO-1抗氧化通路与Ch TLR15/NLRP3炎症信号通路之间的调控关系。为鸡球虫入侵及其与宿主细胞的互作机制研究提供新的思路。研究具体内容如下:为明确柯里拉京和L.brevis 23017对DF-1细胞Nrf2/HO-1抗氧化信号通路的正向激活作用。本研究采用CCK-8和抗氧化酶试剂盒筛选了柯里拉京和L.brevis 23017作用DF-1细胞的剂量与时间,之后以适当的剂量/菌量分别预处理DF-1细胞,检测Nrf2/HO-1抗氧化信号通路及Ch TLR15/NLRP3炎症信号通路相关因子m RNA转录水平;采用Western Blot方法检测p-Nrf2、Nrf2和HO-1蛋白表达水平。结果表明,柯里拉京和L.brevis 23017预处理DF-1细胞后对抗氧化通路Nrf2/HO-1具有显著正向调节作用,15μM柯里拉京(Cori-15μM)和L.brevis 23017菌液上清(Bacterial Supernatant)抗氧化效果最好。为确定柯里拉京和L.brevis 23017是否可以通过调节Nrf2/HO-1抗氧化通路的方式来调控E.tenella子孢子激活的Ch TLR15/CColforsin研究购买h NLRP3炎症通路。本研究建立了E.tenella子孢子入侵DF-1细胞模型。将柯里拉京和L.brevis 23017分别预处理DF-1细胞,用子孢子刺激后检测Nrf2/HO-1和Ch TLR15/NLRP3信号通路相关因子m RNA转录水平;Western Blot检测pNrf2、Nrf2、HO-1、Ch TLR15和Ch NLRP3蛋白表达水平;脂质氧化试剂盒检测丙二醛(MDA)表达水平IACS-010759半抑制浓度与活性氧(ROS)测定试剂盒检测ROS表达水平。结果表明:Cori-15μM和Bacterial Supernatant预处理的DF-1细胞中E.tenella子孢子入侵而引起的Ch TLR15/NLRP3炎症信号通路各因子的表达水平均显著下调;并且MDA和ROS表达量显著下降。表明Cori-15μM和L.brevis 23017菌液上清可通过激活DF-1细胞Nrf2/HO-1抗氧化信号通路来调控子孢子激活的Ch TLR15/NLRP3炎症通路。为进一步明确柯里拉京和L.brevis 23017激活的Nrf2/HO-1抗氧化通路与Ch TLR15/NLRP3炎症通路之间的串话机制。采用RNAi技术分别对DF-1细胞中Nrf2和Ch TLR15的表达进行干扰。将柯里拉京和L.brevis 23017分别预处理Nrf2和Ch TLR15敲低的DF-1细胞,经子孢子刺激后,通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)和Western Blot检测Nrf2/HO-1和Ch TLR15/NLRP3通路相关因子的表达水平。结果表明,柯里拉京和L.brevis23017通过激活Nrf2/HO-1抗氧化通路来抑制E.tenella感染激活的Ch TLR15/Ch NLRP3炎症通路,进而发挥抗炎作用。综上,本研究表明,柯里拉京和L.brevis 23017激活的Nrf2/HO-1抗氧化信号通路通过调控Ch TLR15/NLRP3炎症通路,减缓了鸡球虫入侵细胞过程中所致的炎性损伤,为新型鸡球虫病防控产品的研发提供了新思路。