碳纳米管(Carbon Nanotubes,CNTs)是一种由石墨片卷曲成圆柱体的一维管状结构纳米材料。根据卷曲石墨片层数的不同,CNTs可分为单壁碳纳米管(Single-Walled CNTs,SWCNTs)和多壁碳纳米管(Multi-Walled CNTs,MWCNTs)。与SWCNTs相比,MWCNTs具有合成不需要催化剂,积累纯度高,稳定性强,并且相对容易批量合成的优势。MWCNTs可以积极影响骨相关细胞的生长和分化,在生物医学应用中具有巨大潜力。然而,MWCNTs由于其直径较大,容易引起生物毒性,这对其临床应用造成了很大的障碍。为了克服限制CNTs应用的生物毒性,适当的表面功能化修饰和掺杂生物相容性复合材料等技术可以降低毒性,进而增强CNTs的水溶性和生物相容性。近期的研究已经引起了人们对功能化修饰的MWCNTs在免疫调节和组织工程方面应用的关注。功能化修饰的MWCNTs可主要通过吞噬作用内化到细胞中,诱导显著增强的免疫反应。此外,功能化修饰的MWCNTs还可作为一种有吸引力的策略用于骨组织工程。然而,要将MWCNTs纳入骨组织工程,首先必须系统地了解它们对骨重塑相关细胞的影响。尽管几种MWCNTs已被报道对骨相关细胞的生长、分化以及新骨再生发挥调节作用,但其潜在机制仍有待进一步阐明。深入研究其潜在机制对支持MWCNTs作为治疗动物代谢性骨疾病的潜在生物材料具有重要意义。主要研究内容如下:1、氮掺杂羧基功能化多壁碳纳米管(N-MWCNTs)表征的测定及其安全性评价为获得更低毒性、更好生物相容性的MWCNTs,本研究制备了N-MWCNTs,并利用扫描电子显微术(Scanning electron microscopy,SEM)、透射电子显微术(Transmission electron microscopy,TEM)、X射线光电子能谱仪(X-ray photoelectron spectroscopy,XPS)以及紫外-可见分光光度法(Ultraviolet-visible spectroscopy,UV-Vis)测试手段对N-MWCNTs的形貌、微结构以及元素组成等理化性质进行表征分析,同时还通过流式细胞术和小鼠模型验证N-MWCNTs在体外和体内的生物相容性。结果显示,制备的NMWCNTs呈现出清晰的晶格条纹和独特的喷嘴结构的特征性形态,形态均匀,分散性好,纯度高;且在哺乳动物细胞系和adjunctive medication usage小鼠模型中均表现出良好的生物相容性,可用于后续N-MWCNTs的生物学功能研究。2、N-MWCNTs通过免疫调节增强骨重塑的机制研究为探究N-MWCNTs对骨重塑的调控作用,本研究以骨髓基质细胞(Bone marrow stromal cells,BMSCs)为细胞模型,研究N-MWCNTs对BMSCs中破骨细胞和成骨细胞活性的影响,结果显示,0.2μg/m L N-MWCNTs显著提高了BMSCs中抗酒石酸酸性磷酸酯酶(Tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)和碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AKP)的活性,茜素红S(Alizarin red S,ARS)染色及ARS含量的定量检测进一步证实了N-MWCNTs对BMSCs体外矿化的正向调控。为了系统地探索哪些基因和信号通路受到N-MWCNTs的影响,本研究对0.2μg/m L N-MWCNTs处理8 d的BMSCs进行了RNA-Seq分析,结果显示,N-MWCNTs促进了破骨细胞分化和功能相关基因(RANKL、NFATc1、PU.1、MITF、TRAP和β3-intergrin)和成骨细胞分化和功能相关基因(BMP2、BMP4、Runx1、Runx3、OPN和BSP)m RNA表达。通过RNA干扰试验(RNA interference,RNAi)进一步研究发现,NFATc1和BMP2参与了N-MWCNTs诱导的BMSCs中破骨细胞和成骨细胞活性的调控。RNA-Seq数据显示,N-MWCNTs除了促进BMSCs中骨重塑相关基因m RNA表达外,还触发炎症细胞因子m RNA表达水平发生显著改变。鉴于巨噬细胞的吞噬作用启动先天免疫反应,通过Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)诱导多种促炎因子(如TNF-α、IL1、IL6、IL12等)的转录,由此推测N-MWCNTs可能触发巨噬细胞吞噬,进而激活巨噬细胞骨免疫效应增强骨重塑。为进一步明确上述N-MWCNTs引起免疫反应和几种炎症细胞因子m RNA表达水平的改变是由巨噬细胞吞噬启动,本研究通过共聚焦激光扫描显微术(Confocal laser scanning microscope,CLSM)和TEM成像证实了N-MWCNTs在巨噬细胞中的吞噬体定位。为探究N-MWCNTs能否在体内同样激活巨噬细胞骨免疫效应增强骨重塑,开展了肌肉注射1.0 mg/kg剂量的N-MWCNTs对小鼠体内骨代谢影响的研究。动物实验结果显示,N-MWCNTs给药后,小鼠股骨和胫骨骨指数显著升高。双能X射线吸收仪成像显示,N-MWCNTs给药组小鼠的股骨和胫骨比Vehicle组小鼠的股骨和胫骨更强壮。同样,N-MWCNTs增强了小鼠骨密度(Bone mineral density,BMD)和骨矿物质含量(Bone mineral content,BMC)。N-MWCNTs给药组小鼠股骨和胫骨蛋白提取物质中TRAP和AKP活性增强。此外,N-MWCNTs使小鼠股骨TRAP和ARS阳性染色程度增强。RTq PCR结果显示,N-MWCNTs显著提高了小鼠股骨和胫骨里骨重塑相关基因(BMP2、Runx2、Runx3、COLⅡ、OCN、NFATc1和TRAP)m RNA表达水平。TEM成像证实了小鼠注射部位周围肌肉中的巨噬细胞对N-MWCNTs的摄取。RT-q PCR结果显示,NMWCNTs显著提高了小鼠股骨和胫骨里炎症细胞因子m RNA表达水平。此外,NMWCNT给药后,血清中IL-1α、IL10和IL16含量显著升高。为探究N-MWCNT能否缓解骨质疏松症状,本研究利用双侧卵巢切除法建立雌性昆明白成年小鼠骨质疏松模型,并在术后8周对骨质疏松小鼠给药N-MWCNTs干预。利用Micro CT分析观察N-MWCNTs对骨质疏松小鼠模型中股骨近端松质骨形态学特征的影响。结果显示,与空白组(假手术组)相比,手术Vehicle组小鼠股骨近端松质骨出现骨量减少、骨密度降低以E-616452半抑制浓度及骨小梁数量减少、变细、间距增大以及从板状ICI 46474作用向杆状转变等显著退行性变化;与手术Vehicle组相比,手术N-MWCNTs组小鼠经N-MWCNTs给药干预后骨质疏松症状有所缓解,骨小梁数目(Trabecular bone number,Tb.N)、骨小梁厚度(Trabecular bone thickness,Tb.Th)及BMD均显著升高,骨小梁模式因子(Trabecular bone pattern factor,Tb.Pf)显著下降。综上所述,本研究揭示了N-MWCNTs对骨重塑和骨发育影响。首先,N-MWCNTs在体内外均表现出良好的生物相容性,具备作为潜在治疗性纳米材料的安全性。其次,N-MWCNTs作为外源物被先天免疫系统中的巨噬细胞识别,引发巨噬细胞吞噬,从而增强免疫应答,并伴随着促炎性和抗炎性细胞因子的分泌,这些细胞因子共同诱导与破骨细胞和成骨细胞分化和功能相关基因m RNA表达,从而上调破骨细胞和成骨细胞的活性,刺激骨吸收和骨形成,最终在体外和体内增强骨重塑。最后,通过建立的骨质疏松小鼠模型证实了N-MWCNTs给药干预能够缓解股骨近端松质骨的形态学特征变化。以上结果揭示了N-MWCNTs通过巨噬细胞骨免疫效应增强骨重塑的调节作用。因此,N-MWCNTs可能是用于动物代谢性骨疾病治疗的骨组织工程生物材料。