苹果是世界四大水果之一,我国是全球最大的苹果生产和消费国。苹果产业在增加农民收入、调整产业结构以及乡村振兴等方面起重要作用。近年来,随着我国苹果产业“西移北扩”布局调整,苹果生产逐步向黄土高原、西南高海拔冷凉高地以及新疆等优势区或特色区集中。近年来,这些地区遭遇冬季低温和春季倒春寒愈发频繁,低温成为限制苹果产业发展的主要环境因子之一。作为植物特有的转录因子家族,NAC转录因子在植物的生长发育和对非生物胁迫的响应过程中发挥着广泛的作用。目前,苹果中NAC转录因子调节低温胁迫响应的功能研究较少,相关调控机制也不清楚。本研究以MdNAC104过表达苹果植株为材料,通过多组学联合分析、启动子结合鉴定、转录调控分析等方法,对MdNAC104调节耐寒性的功能进行了鉴定,并探讨了MdNAC104响应低温调节苹果耐寒性的作用机制。主要研究结果如下:1.MdNAC104通过促进渗透调节物质的积累增强苹果植株的耐寒性。低温冻害胁迫条件下,检测低温处理下各植株叶片、茎干和休眠芽中的渗透调节物质的含量。结果表明,转基因植株叶片和茎干中的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量均显著高于GL-3,而丙二醛含量显著低于GL-3对照植株,但休眠芽中渗透调节物质积累和细胞器结构变化不大。这说明,MdNAC104过表达显著促进低温下渗透调节物质在苹果叶片和茎干中的积累,从而提高了苹果的耐寒性。2.MdNAC104通过促进抗氧化酶活性、光合作用效率以及ABA的含量参与调控苹果植株的耐寒性。低温冷害条件下,过表达MdNAC104缓解了低温胁迫对苹果植株生长发育的影响,显著抑制了低温胁迫下苹果叶片中ROS的积累,且增强了抗氧酶活性以清除过剩的ROS。测定Pn、Gs、Tr、Fv/Fm、Y(II)等光合作用能力和叶绿素荧光系统参数指标,结果表明,MdNAC104通过减轻低温胁迫下苹果植株PSII系统的损伤,从而保持高效的光合作用能力。此外,MdNAC104通过改变Md NCED1和Md CPK6基因的转录水平参与调控叶片气孔收缩,影响ABA的积累,进而增强转基因植株的抗冷性。在低温处理15 dcombined bioremediation和30 d后,转基因苹果植株茎干中木质素、纤维素、半纤维素含量和显微解刨结构与野生型相比并没有显著变化,植株中JA、CTK和ACC的含量也没有显著差异。以上结果表明,MdNAC104主要是通过提高苹果植株活性氧清除能力,保持高效光合作用能力,从而增强了苹果植株的低温耐受性。3.转录组及代谢组分析表明MdNAC104促进低温条件下花青素及脯氨酸的生物合成。通过对低温条件下MdNAC104转基因及GL-3植株的转录组分析,发现获得的差异基因主要参与植物激素信号转导、淀粉和蔗糖代谢、植物病原互作、苯丙烷生物合成和黄酮类生物合成等途径中。在我们匹配检测到的973个代谢物中,与GL-3相比,三个转基因株系中分别鉴定到差异代谢物42、42、39个,这些代谢物主要在合成次级代谢产物、精氨酸和脯氨酸代谢、苯丙烷、植物激素以及类黄酮生物合成等通路中富集。进一步的,花青苷(Md CHS、Md CHIAY-22989、Md F3H和Md ANS)及脯氨酸(Mdami、Mdspe D和Md ALDH)合成途径关键基因表达量在转基因植株中显著上调,且对应的代谢物含量也明显升高。这说明MdNAC104可能通过促进花青素及脯氨酸合成途径相关基因的表达,促进低温下它们的积累,从而提高苹果植株的低温耐受性。4.MdNAC104通过CBF依赖及CBF不依赖途径正调节苹果耐冷性。通过启动子结合及转录调控分析,我们发现低温胁迫下MdNAC104能直接结合Md CBF1和Md CBF3的启动子并促进它们表达,从而通过CBF-COCaptisol体外R途径正调节苹果植株耐寒性。另一方面,转录组和代谢组分析结果中鉴定出多个花青苷合成途径关键基因和抗氧化酶编码基因。通过LUC/REN、Y1H、EMSA和Ch IP-q PCR等实验,发现MdNAC104能通过直接激活花青苷合成途径关键基因(Md CHS-b、Md CHI-a、Md F3H-a和Md ANS-b)及抗氧化酶编码基因(Md FSD2和Md PRXR1.1)的表达,促进低温胁迫下的花青苷积累及抗氧化酶活性,增强苹果植株的耐寒性。