流行性感冒是一种由流感病毒(Influenza Virus)感染引起的上呼吸道急性人畜共患传染病,主要通过飞沫和呼吸道分泌物传播,曾造成4次全世界范围内的大流行。根据世界卫生组织(WHO)的数据,全球季节性流感流行每年估计造成300万至500万例重症病例和30万至65万人死亡。接种疫苗是预防控制传染病及其相关并发症最有效的策略。由于流感病毒具有变异迅速的特点,因此季节性流感疫苗生产毒株每年根据病毒的变化预测下一年度可能流行的毒株,必须更换疫苗生产毒株每年重新制备疫苗和易感人群每年都需要接种新毒株生产的疫苗。目前,全球共有“裂解灭活疫苗”、“减毒活疫苗”和“重组HA疫苗”三种类型的流感疫苗,它们在不同的国家被批准使用。以鸡胚为基质生产流感疫苗在全球已有近70年的历史。鸡胚生产平台存在清洁鸡胚供应难、生产周期长、规模化难、操作繁琐、容易污染、含有微量的卵清蛋白可能导致过敏反应、难以应对禽流感爆发等一系列难以避免的问题。鉴于此,早在1995年WHO就提出以细胞培养替代鸡胚培养的流感疫苗生产基质。MDCK(Madin-Darby Canine Kidney)细胞,即马丁·达比犬肾脏细胞,于 1958年由Madin和Darby建立细胞系,后经传代培养建成永生化贴壁上皮细胞系。MDCK细胞易感染多种病毒,被广泛用于流感病毒、腺病毒、犬细小病毒等病毒的研究。直至目前,MDCK是流感病毒感染研究使用最多的细胞系,也是分离、扩增和纯化的AG-221核磁流感病毒较理想的细胞系。在20世纪90年代中期,WHO推荐MDCK细胞用于生产季节性流感疫苗替代鸡胚。2012年,FDA批准MDCK细胞用于基于细胞培养的流感疫苗的生产。目前,全球已有多家MDCK生产的流感疫苗上市,但是在中国流感疫苗市场主要是基于传统鸡胚生产平台的裂解灭活疫苗。由于受鸡胚供应的影响,开发规模化的细胞基质流感是最佳解决方案。细胞的规模化培养主要有两种,一种是基于多表面和堆叠表面的“平面化”贴壁培养,另一种是单细胞悬浮培养。单细胞悬浮培养有着细胞密度大、规模化简单、培养条件稳定且容易控制等优点,因此人们也逐渐驯化了一些贴壁依赖性细胞使其进行悬浮培养,目前报道已biologic medicine经成功驯化的贴壁细胞有MDCK细胞、BHK-21细胞、CHO细胞等。MDCK细胞传统培养依赖于贴壁,生物制品行业一直以来关注的是提高产品的生产率的同时降低成本,悬浮培养提供了更高的细胞密度和更容易的工艺放大。以上研究提示,建立优质的MDCK悬浮细胞系和细胞悬浮培养大规模制备流感病毒工艺变得十分重要。因此,本文以MDCK细胞和流感病毒为主要研究对象,驯化MDCK细胞悬浮培养并对其进行检定,试图建立MDCK细胞为基质的悬浮培养制备的流感病毒工艺。首先,本文利用软琼脂糖克隆形成实验对引进的MDCK细胞纯化,得到23个细胞克隆,其中MDCK-R11和MDCK-R18的克隆形成率最低,分别为1.13%、1.18%,其余细胞克隆的形成率都高于1.20%。然后,选取克隆形成率最低的MDCK-R11通过“摇床培养适应法”将其成功驯化进行悬浮培养,支持无血清单细胞悬浮培养,命名为MDCK-S。整个驯化时间约18天,悬浮培养倍增时间约为27.16h,摇瓶中细胞密度可达1×107cells/mL对MDCK-S细胞进行18S测序鉴定和物种特异性PCR鉴定,Colforsin配制结果显示18S序列与MDCK(NBL-2)序列一致,特异性PCR显示MDCK-S为狗源细胞,表明MDCK-S未受到其它细胞系污染。其次,对MDCK-S进行了主要指标的检定,结果表明MDCK-S细胞传代稳定、细胞状态好、细胞周期及生长代谢稳定;没有受到其他细胞系、细菌、真菌、病毒或支原体的污染;软琼脂糖克隆形成实验显示MDCK-S在P29、P33、P36、P45、P50上的克隆形成率分别为2.41%、2.27%、2.40%、2.17%、2.15%,各代次之间无显著差异,与Hela细胞(1.84%)相当无显著差异,与贴壁对照组(P24)的克隆形成率(2.11%)无显著差异。染色体数目测定结果显示MDCK-S细胞29～50代细胞染色体保持稳定,78±2条染色体占比86%以上。另外,致瘤性检查显示MDCK-S细胞50代细胞无致瘤性。最后,测试了 MDCK-S细胞对流感病毒H3N2、H1N1、B-V、B-Y的敏感性,发现MDCK-S细胞对4种亚型的敏感性与MDCK(NBL-2)细胞相当。基于此,利用DoE设计研究和高通量“摇管”模型确定和优化了 MDCK-S细胞摇瓶悬浮培养H3N2的适宜培养条件,即为:pH=7.88～8.00,MOI=0.001、TPCK终浓度1.70μ g/mL～6.0μg/mL和细胞密度55.70～77.28×105cells/mL,病毒维持培养基为Xene-S001培养基,培养温度为34.5℃,培养时间为72h,摇床转速为100rpm/min,C02含量为3%,此条件下流感病毒H3N2滴度为6.5 1gTCID50/ml。在此基础上,通过小规模悬浮培养流感病毒H3N2,建立了 MDCK-S悬浮培养流感病毒H3N2制备流感病毒的纯化工艺。采用0.65μm滤柱、300KDa超滤浓缩、Benzonase核酸酶处理、Capto Core 700、Capto Q 步骤纯化。Capto Core 700、Capto Q 对血凝素回收率分别为55.03±2.01%、66.27±3.67%。整个工艺流程制备的灭活病毒满足药典要求,工艺总蛋白去除率为97.94±0.09%、宿主蛋白去除率为99.46±0.03%、rcDNA(residual host cell DNA)去除率为99.99±0.01%。纯化工艺中,采用核酸酶降解rcDNA和两步柱纯化,提高了 MDCK-S细胞制备流感病毒的安全性。灭活病毒免疫BALB/c小鼠,血凝抑制实验测定血清中血凝抑制抗体,本工艺制备的流感病毒H3N2与鸡胚培养的灭活病毒,血凝抑制抗体滴度无显著性差异,具有良好的免疫原性和安全性。综上,本研究建立了 MDCK细胞悬浮培养驯化方法,悬浮培养MDCK细胞对流感病毒敏感,具有良好的安全性和免疫原性,可以为流感病毒的大规模制备提供新的方法与思路。