胃癌是对人类健康和生活质量构成严重威胁的恶性肿瘤之一。对于早期胃癌患者,手术切除是最佳的治疗选择。然而,胃癌发病过程非常隐匿,早期临床症状不典型。多数患者在确诊时存在局部或远处转移,已处于胃癌进展期,失去了根治性手术治疗的机会。此外,手术后肿瘤复发也是胃癌高死亡率的原因之一。尽管新辅助化疗、靶向治疗和免疫治疗取得了发展和进步,但目前胃癌的各种治疗方案均存在一定的局限性,因此进一步寻找潜在的胃癌预后和精准治疗标志物至关重要。RNA甲基化是一种常见的表观遗传修饰,其失调与人类癌症的发展密切相关。RNA 5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,m5C)甲基化是指RNA胞嘧啶的第五位C被甲基化修饰,是主要的RNA转录后修饰之一。随着高通量测序技术的进步,RNA m5C甲基化修饰在m RNAs和非编码RNAs上的分布和生物学功能逐渐被发现,其在调节RNA翻译、稳定性、出核以及多种生物学过程中发挥了重要作用。长链非编码RNAs(long noncoding RNAs,lnc RNAs)是长度大于200个核苷酸的非编码RNAs,因缺乏有意义的开放阅读框,不具有编码蛋白质的功能。但是,lnc RNAs可通过表观遗传、转录、转录后修饰等多种途径调控基因表达,在肿瘤细胞的增殖、侵袭、凋亡等生物学过程中发挥重要的调节作用,其可以作为致癌或抑癌因子参与肿瘤的发生发展。肿瘤免疫微环境(tumor immune microenvironment,TIME)在介导促肿瘤和抗肿瘤免疫反应中尤为重要,lnc RNAs可通过调控TIME中免疫细胞的分化、增殖、分泌因子等生物学过程,影响肿瘤的发生、发展。lnc RNAs有望成为新型肿瘤标志物和治疗靶点,用于肿瘤的诊断、治疗和预后监测。本研究拟利用肿瘤基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库的资料,通过生物信息学方法筛选出具有胃癌预后价值的m5C相关lnc RNAs并构建风险模型。评估风险评分与免疫细胞浸润、免疫细胞功能、免疫检查点基因表达和化疗药物敏感性的关联。通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)检测患者的胃癌组织和癌旁组织中m5C相关lnc RNAs的表达情况,并系统评估这些lnc RNAs与患者临床病理特征和预后的关系。具体研究分为以下三个部分:第一部分m5C相关lnc RNAs胃癌预后风险模型的构建及验证目的:筛选胃癌预后m5C相关lnc RNAs生物标志物,构建预后风险模型和临床预后列线图。方法:从TCGA数据库中下载正常样本和胃腺癌患者的临床信息以及RNA测序数据。分析胃癌和正常样本中m5C甲基化调控基因的差异性表达。通过Pearson相关性分析构建m5C甲基化调控基因与lnc RNAs的共表达关系,鉴定出胃癌的m5C相关lnc RNAs。通过单因素Cox回归分析、Kaplan-Meier分析和多因素Cox回归分析确定预后m5C相关lnc RNAs特征(m5C-related lnc RNAs signature,m5C-RLSig),基于此构建预后风险模型。Kaplan-Meier分析用于比较不同组别患者的总生存率。结合临床病理信息及患者的风险评分进行单因素和多因素Cox回归分析,以验证模型的独立性。构建临床预后列线图,校准曲线用于比较列线图预测的存活率和实际存活率之间的拟合。结果:与正常对照相比,13个m5C甲基化调控基因中,有11个在胃癌组织中高表达。通过Pearson相关性分析,在胃癌中获得了565个m5C相关lnc RNAs,从中确定了构建风险模型所需的6个预后m5C相关lnc RNAs。基于此构建的风险模型可有效预测胃癌患者预后,高危组的总生存率更低,生存状态更差。m5C-RLSig风险评分是胃癌患者预后的独立危险因素。风险评分与临床分期、病理分级、N分期和生存状态显著相关,风险评分高的患者更容易出现晚期临床病理特征。利用m5C-RLSig风险评分和临床病理因素构建的预后列线图,可以准确地预测胃癌患者的1年、3年和5年生存率。结论:1.基于HAGLR、AC009948.1、AC005586.1、AL590666.2、AP001271.1和IPO5P1,这6个m5C相关lnc RNAs构建的风险模型可有效预测胃癌患者预后。2.利用m5C-RLSig风险评分构建的列线图,可作为预测胃癌患者预后的有效量化工具。第二部分胃癌中m5C相关lnc RNAs的免疫浸润特征及治疗价值目的:探索m5C相关lnc RNAs参与的生物功能及潜在的信号通路,评估m5C-RLSig的胃癌免疫浸润特征及个体化治疗价值。方法:使用基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)执行基因本体论(Gene Ontology,GO)功能注释,并探索m5C相关lnc RNAs参与的京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)信号通路。利用CIBERSORT算法(Cell-type Identification By Estimating Relative Subsets Of RNA Transcripts,CIBERSORT)对免疫细胞的表达矩阵进行分析并量化免疫细胞浸润比例。利用单样本基因集富集分析(single-sample gene set enrichment analysis,ss GSEA)评估风险评分与免疫细胞和免疫功能的关系。分析高、低危组的免疫检查点基因表达水平和化疗药物敏感性,评估m5C-RLSig的治疗价值。结果:GO富集分析显示,免疫球蛋白结合,胶原蛋白三聚体等生物功能在高危组中富集。KEGG富集分析显示,鞘糖脂生物合成神经节系列、神经活性配体-受体相互作用等通路在高危组中富集。胃癌高危组和低危组的免疫细胞浸润比例存在差异,高危组中活化的NK细胞、静息肥大细胞和静息树突状细胞的浸润比例升高,而静息NK细胞的浸润比例下降。ss GSEA结果显示,高危组的多种免疫细胞(a DCs、B细胞、DCs、i DCs、巨噬细胞、肥大细胞、中性粒细胞、p DCs、T辅助细胞、TIL细胞、Tregs)富集评分高于低危组。高危组的免疫功能(APC共刺激、CCR、HLA、副炎症、T细胞共刺激、I型IFN反应、Ⅱ型IFN反应)富集评分高于低危组。免疫检查点基因TNFRSF14、TNFRSF25在低危组中高表达。低危组对化疗药物顺铂、紫杉醇的敏感度高于高危组。结论:1.免疫球蛋白结合,胶原蛋白三聚体,鞘糖脂生物合成神经节系列等生物功能及信号通路在高危组中富集。2.m5C-RLSig风险评分可以区分胃癌的免疫浸润特征。3.免疫检查点基因TNFRSF14、TNFRSF25在低危组中高表达,低危组对化疗药物顺铂、紫杉醇更敏感,m5C-RMDV3100说明书LSig可成为免疫及化疗的生物标志物。第三部分m5C相关lnc RNAs在胃癌组织中的表达及临床意义目的:检测第一部分研究所得到的6个m5C相关lnc RNAs在临床组织标本中的表达水平,分析这些lnc RNAs表达水平与胃癌患者临床病理特征和预后的关系。方法:收集患者胃癌组织及癌旁组织标本,采用q RT-PCR检测HAGSBE-β-CD MWLR、AC009948.1、AC005586.1、AL590666.2、AP001271.1和IPO5P1的表达水平。利用卡方检验分析以上lnc RNAs在胃癌组织中的表达水平与患者临床病理特征(性别、年龄、肿瘤大小、病理分化程度、脉管浸润、浸润深度、淋巴结转移、TNM分期)的相关性。采用Kaplan-Meier法和Log-rank检验分析lnc RNAs表达水平与胃癌患者预后的关系。结果:共纳入52例胃癌患者,与癌旁组织相比,HAGLR和AC009948.1在胃癌组织中的表达上调,AC005586.1、AL590666.2、AP001271.1和IPO5P1在胃癌组织中的表达下调。HAGLR表达与淋巴结转移、TNM分期相关;AC009948.1表达与肿瘤大小、淋巴结转移、浸润深度相关;AC005586.1表达与肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期相关;AL590666.2表达与淋巴结转移、浸润深度、TNM分期相关;AP001271.1表达与病理分化程度、淋巴HLA-mediated immunity mutations结转移相关;IPO5P1表达与病理分化程度、脉管浸润、淋巴结转移相关。HAGLR、AC009948.1高表达的患者总生存率较低,AC005586.1、AL590666.2、AP001271.1和IPO5P1低表达的患者总生存率较低。结论:1.HAGLR和AC009948.1在胃癌组织中表达上调,其高表达的患者总生存率较低。2.AC005586.1、AL590666.2、AP001271.1和IPO5P1在胃癌组织中表达下调,其低表达的患者总生存率较低,m5C-RLSig有望成为胃癌预后评估的潜在生物标志物。