背景:白内障(Cataract)作为首位致盲性眼病,是影响老年人眼部健康的主要“杀手”。目前认为,氧化应激导致的晶状体上皮细胞(Lens epithelial cells,LECs)衰老是白内障发生发展的主要因素。LECs作为高耗氧细胞,对线粒体功能更加依赖。目前研究发现线粒体功能障碍可能是导致LECs衰老的主要原因。然而,如何靶向线粒体抵抗衰老目前尚不清晰。最近研究显示二甲双胍(Metformin)可以通过靶向线粒体延缓细胞衰老和治疗衰老相关疾病,为探讨线粒体在细胞衰老中的作用提供了新方法。提示我们进一步探索重建功能性线粒体的方法可能是延缓高耗氧LECs衰老,治疗白内障的途径之一。氧化磷酸化(oxidative phosphorylation,OXPHOS)作为线粒体的核心功能,其复合体异常是细胞衰老早期的预警信号。线粒体是一个双基因组控制的细胞器,核基因与线粒体基因编码的OXPHOS亚基的协调表达是OXPHOS复合体发挥功能的关键。其中核基因编码的线粒体蛋白作为核与线粒体之间的媒介分子,在维持线粒体功能上具有重要作用。因此调节线粒体核基因编码蛋白的表达可能是LECs衰老时重塑线粒体功能的有效方式。以往对于核基因编码蛋白的调控的研究多集中于转录水平,最近研究发现翻译等转录后水平的调控同样作为基因表达调控的重要一环,可以比转录水平更快速,更灵活地协调不同类型的蛋白质的表达,以响应细胞应激下的变化。这提示从翻译等转录后水平调控线粒体核基因编码蛋白的表达,可能是氧化应激调节LECs的线粒体功能更快速、灵活的方式。最近的研究发现,在氧化应激下,应激颗粒(stress granules,SGs)等核糖核蛋白颗粒(Ribonucleoprotein granules,mRNPs)的形成是细胞响应应激,调节核基因编码蛋白翻译的重要方式。SG是通过RNA结合蛋白(RNA binding protein,RBP)驱动液-液相分离而介导其与靶mRNA募集形成的动态聚集体。其通过临时隔离和储存RBP与其靶mRNA,从而暂时性地形成蛋白翻译抑制平台,实现应激下对mRNA翻译的调控。研究表明,RBP异常表达导致病理性SGs的形成与细胞衰老和神经性退行疾病密切相关。所以提示RBP异常表达导致的病理性SGs的形成可能与氧化磷酸化功能异常导致的细胞衰老有关。LARP1(La-相关蛋白1,La-related protein 1)是一种RNA结合蛋白,最近研究表明其可通过结合线粒体OXPHOS复合体亚基的mRNA并调控其蛋白翻译。提示以LARP1为切入点,探讨线粒体OXPHOS复合体亚基在LECs衰老中的作用机制,可能是阐明LECs衰老的一个新途径。因此,本学位论文以LECs(SRA01/04)为研究对象,利用D-半乳糖(D-galactose)构建细胞衰老模型,观察二甲双胍抗衰老作用的基础上,探究RNA结合蛋白LARP1对OXPHOS亚基翻译的影响,观察病理性SGs的形成,探讨线粒体OXPHOS在LECs衰老中作用机制,为LECs衰老诱导的白内障治疗提供新的靶点。方法:一.观察D-半乳糖诱导细胞SRA01/04衰老时线粒体功能的变化1.利用不同浓度的D半乳糖和二甲双胍处理SRA01/04细胞48h后,MTT法检测细胞活性。2.D-半乳糖单独或联合二甲双胍作用于SRA01/04细胞6h、48h后,Western Blot 法及实时荧光定量 PCR(Real-time Quantitative PCR,RT-qPCR)技术检测SRA01/04细胞的p16、p21、p53的蛋白表达和mRNA水平;β-半乳糖苷酶染色法检测β-半乳糖苷酶活性。3.D-半乳糖单独或联合二甲双胍作用于SRA01/04细胞6h、48h后,利用DCFH-DA染色流式细胞术法检测细胞内总ROS水平;JC1染色流式细胞术法检测线粒体膜电势变化;荧光探针法检测细胞氧气消耗速率(OCR);荧光素酶催化荧光素法检测ATP的生成水平。4.D-半乳糖单独或联合二甲双胍作用于SRA01/04细胞6h、48h后,Western Blot法检测OXPHOS复合体亚基的蛋白表达变化,RT-qPCR法检测OXPHOS复合体亚基的mRNA水平变化;在D-半乳糖单独或联合二甲双胍作用于SRA01/04细胞48h后,使用溶酶体抑制剂氯喹阻断自噬,Western Blot法检测细胞内自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、p62的蛋白表达。二.确定LARP1对衰老细胞的线粒体功能的影响1.D-半乳糖单独或联合二甲双胍作用于SRA01/04细胞6h、48h后,Western Blot法检测LARP1的蛋白表达;RT-qPCR法检测LARP1的mRNA水平;干扰LARP1表达后在D-半乳糖的作用下,Western Blot法检测p16、p21、p53的蛋白表达水平;β-半乳糖苷酶染色法检测β-半乳糖苷酶活性。2.干扰LARP1表达后在D-半乳糖的作用下,利用DCFH-DA染色流式细胞术法检测细胞内总ROS水平;JC1染色流式细胞术法检测线粒体膜电势变化;荧光探针法检测细胞氧气消耗速率(OCR);荧光素酶催化荧光素法检测ATP的生成水平。3.干扰LARP1表达后在D-半乳糖的作用下,Western Blot法检测OXPHOS复合体亚基的蛋白表达变化。三.探讨影响LARP1诱导衰老的主要因素在D-半乳糖作用于SRA01/04细胞6h、48h后,利用免疫荧光法对SG标志蛋白G3BP1和LARP1进行免疫荧光染色,观察LARP1与G3BP1的共定位。结果:一.OXPHOS障碍与D-半乳糖诱导SRA01/04细胞衰老有关1.在200mM的D-半乳糖作用下,LECs细胞的活力开始出现明显的下降,并在联合1.6mM的二甲双胍处理细胞后,细胞活力出现明显的增加。后续的实验中,选取浓度为200mM的D-半乳糖作为诱导细胞衰老的的亚致死剂量,使用1.6mM的二甲双胍作为D-半乳糖诱导细胞衰老的抗衰对照。2.在D-半乳糖作用下,p16、p21、p53的蛋白和mRNA水平显著增加,β-半乳糖苷酶染色阳性细胞明显增多,联合二甲双胍处理细胞后,p16、p21、p53的蛋白和mRNA水平显著降低,β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数明显减少,表明D半乳糖作用下,LECs细胞发生了明显的衰老,二甲双胍延缓了 LECs衰老。3.在D-半乳糖作用下,LECs细胞内的ROS含量明显升高;线粒体膜电位显著下降;细胞氧气消耗速率降低;ATP生成水平下降。在联合二甲双胍作用后,ROS含量下降;线粒体膜电位上升;氧气消耗速率以及ATP生成水平升高。表明OXPHOS功能在细胞衰老中发生减退。4.在D-半乳糖作用下,核基因编码的OXPHOS亚基蛋白表达减少,线粒体基因编码的OXPHOS亚基蛋白表达无明显变化;核基因与线粒体基因编码OXPHOS亚基的mRNA水平均无明显selleck LY-188011变化;细胞的自噬(流量)水平降blood biochemical低,联合二甲双胍处理细胞后,核基因编码OXPHOS亚基的蛋白水平升高;自噬(流量)水平增强。表明在D-半乳糖诱导的细胞衰老中,核基因编码OXPHOS亚基的减少是导致OXPHOS功能发生减退的原因,其变化可能与翻译等转录后调控有关。二.LARP1与D-半乳糖诱导的OXPHOS障碍有关1.在D-半乳糖作用下,LARP1的蛋白水平和mRNA水平均显著上升,联合二双胍作用后,LARP1水平明显下降;在干扰LARP1表达后在D-半乳糖的作用下,p16、p21、p53的蛋白表达减少,β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数减少,表明在D-半乳糖作用下,LARP1的增加可能促进了 LECs衰老。2.干扰LARP1表达后在D-半乳糖的作用下,细胞内总ROS水平下降;线粒体膜电位升高;细胞耗氧速率和ATP生selleckchem SCH772984成水平升高。表明干扰LARP1表达恢复了在D-半乳糖作用下的OXPHOS功能。3.干扰LARP1表达后在D-半乳糖的作用下,与NC+D-gal组相比siLARP1+D-gal组的核基因编码的OXPHOS亚基蛋白表达增多。表明干扰LARP1表达恢复了 LECs衰老中核基因编码的OXPHOS亚基蛋白表达。三.病理性应激颗粒形成可能是影响LARP1调控LECs衰老的主要因素之在D-半乳糖作用下,LARP1与G3BP1共定位,表明在LARP1存在于D半乳糖诱导的应激颗粒中,随着D-半乳糖作用时间延长,应激颗粒由离散型的点状颗粒融合成大的病理性聚集体。结论:1.线粒体核基因编码OXPHOS复合体亚基(复合体Ⅰ-NDUFB8、复合体Ⅱ-SDHB、复合体Ⅲ-UQCRC2)的减少导致是LECs细胞衰老时OXPHOS功能障碍的主要原因。2.LARP1通过抑制核基因编码的OXPHOS复合体亚基(复合体Ⅰ-NDUFB8、复合体Ⅱ-SDHB、复合体Ⅲ-UQCRC2)蛋白的表达,从而诱导衰老细胞OXPHOS功能障碍。3.病理性应激颗粒的形成可能是LARP1诱导OXPHOS功能障碍诱发LECs衰老的主要影响因素之一。综上,从病理性SG与RNA结合蛋白LARP1的角度,探讨了抑制线粒体核基因编码OXPHOS亚基表达而导致LECs衰老的机制,为LECs衰老诱导的白内障治疗提供新的靶点。