研究背景复发性流产(recurrent spontaneous abortion,RSA)是指与同一配偶连续发生2次及以上在妊娠28周之前的妊娠丢失。RSA的病因复杂,目前明确的病因包括遗传因素、解剖因素、内分泌因素、免疫因素、血栓前状态、感染等。除此之外,仍有50%以上的RSA患者病因不明确,称之为原因不明复发性流产。RSA反复发作,极大的影响育龄期女性的身心健康。因此,深入研究其发病机制,寻找有效的防治方法具有重要意义。成功妊娠取决于母胎界面免疫耐受状态的维持,免疫平衡的失调会造成妊娠丢失在内的多种不良妊娠状态。蜕膜免疫细胞是母胎免疫耐受的基础,巨噬细胞是一种在妊娠过程中至关重要的免疫细胞,参与调控着床、母胎界面的血管重塑、胎盘形成、胎儿发育、分娩等一系列事件。巨噬细胞的功能包括调节炎症反应、清除细胞碎片和保护细胞免受病原体侵害等。小鼠妊娠后子宫内膜的巨噬细胞活性下降并维持在较低水平,此时巨噬细胞消化处理抗原的活性减弱、抗原加工能力降低,利于降低子宫局部的免疫水平,保护胚胎免受母体的排斥。过度活化的巨噬细胞运动、吞噬功能增加,同时产生大量促炎细胞因子和其它炎症介质,进一步增强、扩大免疫应答和炎症反应,不利于妊娠维持。细胞自噬是依赖溶酶体参与的分解代谢过程,降解细胞内衰老的细胞器、受损的细胞结构,以及其他生物大分子等,是一种细胞降解和循环系统,对于维持细胞稳态发挥重要作用。巨噬细胞自噬在巨噬细胞极化、慢性炎症和器官纤维化中起着重要作用。最近的研究已经开始阐明自噬与巨噬细胞功能之间的内在联系。巨噬细胞自噬水平的高低不仅影响其活化、分类和死亡,还影响炎性体的活化和炎性细胞因子的释放。维甲酸干扰素联合诱导的细胞凋亡基因(Gene associated with retinoid-IFN-induced mortality 19,GRIM-19)是调控细胞凋亡和线粒体功能的基因。GRIM-19是线粒体呼吸链复合物Ⅰ的基本亚单位,对复合体Ⅰ-Ⅳ的装配以及整个线粒体呼吸链的电荷转移和电化学势能的维持都是必需的,GRIM-19缺乏会导致线粒体结构、功能以及细胞内分布的异常。GRIM-19通过调控肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭、能量代谢重排、上皮间质转化等多个方面参与肿瘤的发生发展。近期的研究发现GRIM-19在调节免疫反应和炎症方面的重要作用。但是GRIM-1selleck产品9对巨噬细胞功能的调控作用及机制目前还没有相关报道。研究目的本研究的目的是探讨GRItethered spinal cordM-19表达异常与流产发生的相关性,并从巨噬细胞自噬的角度研究GRIM-19对巨噬细胞炎性因子分泌和吞噬功能的调控,揭示RSA相关发病机制。第一部分 GRIM-19表达水平与流产发生的相关性研究研究方法1.构建Grim-19+/-敲除小鼠模型,Grim-19+/-雌鼠与野生型雄鼠交配,观察胚胎吸收率,借助小鼠模型研究GRIM-19表达异常与流产发生的相关性。2.收集RSA患者及对照组计划外妊娠行人工流产患者蜕膜组织,分离CD14+蜕膜巨噬细胞,Western Blot检测GRIM-19表达,采用临床标本研究GRIM-19表达与RSA发生的相关性。研究结果1.Grim-19+/-雌鼠与野生型雄鼠交配后,发现Grim-19+/-雌鼠胚胎吸收率显著高于野生型雌鼠,提示GRIM-19表达降低与流产发生相关。2.RSA患者CD14+蜕膜巨噬细胞中GRIM-19表达显著低于对照组患者,提示蜕膜巨噬细胞GRIM-19表达降低参与RSA进展。研究结论我们通过Grim-19+/-小鼠模型证实GRIM-19表达降低与流产的发生相关,并且RSA患者蜕膜巨噬细胞中GRIM-19表达异常降低。第二部分GRIM-19对巨噬细胞自噬的调控作用研究研究方法1.分离Grim-19+/-孕鼠子宫单个核细胞,Western Blot检测自噬相关蛋白Beclin1、LC3B Ⅱ/Ⅰ、BNIP3的表达,流式细胞术检测Grim-19+/-小鼠子宫单个核细胞中CD45+CD11b+F4/80+LC3B+细胞比例,研究GRIM-19对巨噬细胞自噬的调控。2.培养小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞和人白血病单核细胞系THP-1细胞,分别转染特异性siRNA下调GRIM-19表达或转染pcDNA3.1-GRIM-19质粒上调GRIM-19 表达后,Western Blot 检测 自噬相关蛋白 Beclin1、LC3B Ⅱ/Ⅰ、BNIP3 的表达。下调RAW264.7细胞GRIM-19表达后,透射电镜观察自噬体形成。3.收集RSA患者及对照组计划外妊娠行人工流产患者蜕膜组织,分离CD14+蜕膜巨噬细胞,Western Blot检测自噬相关蛋白Beclin1、LC3B Ⅱ/Ⅰ、BNIP3的表达。研究结果1.Western Blot结果显示,Grim-19+/-孕鼠子宫单个核细胞自噬相关蛋白Beclin1、LC3B II/I、BNIP3表达显著提高。流式细胞术检测结果显示,Grim-19+/-孕鼠子宫单个核细胞中CD45+CD11bEpigenetics抑制剂+F4/80+LC3B+细胞比例显著高于野生型小鼠。2.转染特异性siRNA显著下调RAW264.7细胞和THP-1细胞GRIM-19表达后,自噬相关蛋白Beclin1、LC3B Ⅱ/Ⅰ、BNIP3表达显著提高。转染pcDNA3.1-GRIM-19表达质粒显著上调RAW264.7细胞和THP-1细胞中GRIM-19表达后,自噬相关蛋白Beclin1、LC3B Ⅱ/Ⅰ、BNIP3表达显著降低。透射电镜结果显示,下调GRIM-19后RAW264.7细胞自噬体数量增多。3.Western Blot结果显示,RSA患者CD14+蜕膜巨噬细胞中,自噬相关蛋白Beclin1、LC3B Ⅱ/Ⅰ、BNIP3表达显著高于对照组患者。研究结论我们通过Grim-19+/-小鼠模型、体外培养巨噬细胞细胞系以及RSA患者流产蜕膜标本,证实GRIM-19调控蜕膜巨噬细胞自噬水平。第三部分GRIM-19通过调控巨噬细胞自噬参与RSA发生的机制研究研究方法1.分离Grim-19+/-孕鼠子宫单个核细胞,实时荧光定量PCR检测炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达,研究GRIM-19对炎性因子表达调控。2.培养RAW264.7细胞,转染siRNA下调GRIM-19表达后,采用自噬抑制剂3-MA处理细胞,ELISA检测细胞上清炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平,研究GRIM-19 是否通过调控 自噬影响巨噬细胞炎性因子表达。3.培养RAW264.7细胞,转染siRNA下调GRIM-19表达后,采用自噬抑制剂3-MA处理细胞,流式细胞术检测细胞吞噬FITC-Dextran的能力。4.培养THP-1细胞,PMA诱导巨噬细胞后,转染siRNA下调GRIM-19表达,转录组学测序筛选差异表达基因,进行KEGG和GO分析。研究结果1.实时荧光定量PCR结果显示,Grim-19+/-孕鼠子宫单个核细胞炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达高于野生型小鼠。2.ELISA检测结果显示,RAW264.7细胞下调GRIM-19表达后,细胞上清炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著提高,3-MA抑制自噬后,可显著降低炎性因子水平。3.流式细胞术检测结果显示,RAW264.7细胞下调GRIM-19表达后,巨噬细胞吞噬能力显著提高,3-MA抑制自噬后,可显著降低巨噬细胞吞噬能力。4.转录组学测序结果发现,GRIM-19表达下调后,THP-1诱导来源的巨噬细胞中表达上调基因914个,表达下调基因980个。GO富集分析显示,GRIM-19表达下调后巨噬细胞差异基因在免疫调控方面富集,包括调节免疫应答、炎症反应、中性粒细胞、单核细胞、白细胞和嗜酸性粒细胞趋化等。KEGG分析结果显示差异基因在PI3K-AKT信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、趋化因子信号通路、TNF信号通路等免疫和炎症通路变化显著。这些结果提示,GRIM-19表达下调参与巨噬细胞免疫调控和炎症反应。研究结论我们通过体内体外实验证实GRIM-19通过调控细胞自噬影响蜕膜巨噬细胞功能,包括炎性因子分泌和吞噬能力,参与RSA的发生。结论1.我们通过Grim-19+/-小鼠模型证实GRIM-19表达降低与流产的发生相关,RSA患者蜕膜巨噬细胞中GRIM-19表达异常降低。2.我们通过体内体外实验证实GRIM-19通过调控细胞自噬影响巨噬细胞功能,包括炎性因子分泌和吞噬能力,参与RSA的发生。