研究目的:骨质疏松(osteoporosis,OP)是一种以骨量降低和骨微环境破坏为主要特征的全身性骨代谢疾病。女性OP患者所占比例高达70%,由绝经引发的雌激素水平降低,是女性骨量降低的主要因素。科学规律性运动能够改善骨重塑进程,防治骨丢失。破骨细胞主导的骨吸收是骨重塑进程的重要环节,对骨量调控起关键作用。但运动在调控骨吸收进程中的具体机制尚不清楚。运动代谢产物乳酸作为G蛋白偶联受体81(G protein-coupled receptor 81,Gpr81)的唯一内源性配体,可能在调控破骨细胞功能中发挥重要作用。本研究构建Gpr81基因敲除小鼠模型和去卵巢手术(OVX)诱导骨量丢失小鼠模型,采用产生乳酸的高强度间歇训练(High-intensity Interval Training,HIIT)作为运动干预方案,通过体内和体外实验,分析运动调控OVX小鼠骨吸收进程的作用,并进一步揭示其分子机制,为防治骨代谢相关疾病提供潜在的治疗靶点。研究方法:(1)实验分组:将60只SPF级别的C57BL/6野生型(Wild type,WT)小鼠和Gpr81-/-小鼠,体重18-20g,随机分到以下10组:WT组、Gpr81-KO组、WT+Sham(野生型+假手术)组、WT+OVX(野生型+去卵巢手术)组、WT+OVX+HIIT(野生型+selleck抑制剂去卵巢手术+高强度间歇运动)组、WT+OVX+Lac(野生型+去卵巢手术+乳酸注射)组、Gpr81-KO+Sham(基因敲除+假手术)组、Gpr81-KO+OVX(Gpr81基因敲除+去卵巢手术)组、Gpr81-KO+OVX+HIIT(Gpr81基因敲除+去卵巢手术+高强度间歇运动)组、Gpr81-KO+OVX+Lac(基因敲除+去卵巢手术+乳酸注射)组。(2)Gpr81基因敲除小鼠模型:利用CRISPR/Cas9技术敲除Gpr81基因,获得Gpr81全敲小鼠模型(Gpr81-KO);(3)骨量丢失小鼠模型的构建:适应性喂养1周后假手术组小鼠背部手术后仅取少量脂肪组织,保留卵巢完整。其余各组均进行OVX手术摘除卵巢;(4)运动干预方式:小鼠在坡度为0°跑步机上进行每周5天的高强度间歇运动,共持续8周。先进行10min速度为10m/min的热身,随后进行10次跑台速度为80%～90%最大速度的间歇运动,每次持续4分钟,中间进行2分钟速度为40%～50%最大速度的调整运动;在适应期结束及第2、4、6周对小鼠进行最大运动能力测试,调整训练期的跑步速度,使小鼠运动过程中接近最大摄氧量;(5)乳酸注射及检测:以生理盐水作为溶剂,配置200mg/ml的L-乳酸钠溶液。OL组小鼠按照1g/kg的剂量腹腔注射乳酸,每周5次,共持续8周。此外每隔两周用Lactate Scout4乳酸检测仪采集各组小鼠尾部血乳酸浓度,WT+OVX+HIIT组小鼠于运动结束后即刻采集血乳酸;(7)骨组织形态计量学指标:取小鼠股骨,通过Micro-CT取生长板下100张图片分析松质骨骨密度(BMD)和松质骨体积/骨组织总体积(BV/TV)、单位体积内骨小梁厚度(Tb.Th)、单位体积内骨小梁数目(TB.N)等指标;(8)破骨细胞体外分化:将骨髓源巨噬细胞(Bone marrow-derived macrophages,BMMs)以每孔10000个细胞接种于96孔板中,加入含有10%FBS的α-MEM培养基,同时分别加入终浓度为10ng/ml和50ng/ml的M-CSF和RANKL将其诱导分化成破骨细胞,隔天换液,将单核骨髓源巨噬细胞诱导分化为成熟的多核破骨细胞,通过TRAP染色分析破骨细胞分化能力,并通过ipp统计破骨细胞数量和破骨细胞面积;(9)破骨细胞蛋白提取和蛋白免疫印迹:分化成熟的破骨细胞用PBS清洗后加入RIPA裂解液,收集细胞裂解液上清,利用试剂盒提取蛋白。蛋白浓度用BCA法测定后,selleck化学进行SDS-PAGE蛋白电泳并转移到PVDF膜上。封闭后,孵育抗体,然后再用含populational genetics有HRP标记的IgG的封闭液孵育。用ECL超敏发光液发光,并在X-光胶片上曝光。检测破骨细胞中Gpr81、p-p65蛋白表达的水平。研究结果:(1)与WT组相比,Gpr81-KO组小鼠的松质骨BMD、BV/TV、Tb.Th、Tb.N等指标显著降低(P<0.01),颅骨/股骨破骨细胞活性增加。(2)与WT+Sham相比,WT+OVX组小鼠体重显著增加(P<0.01);与WT+OVX小鼠相比,WT+OVX+Lac和WT+OVX+HIIT小鼠的体重均显著的降低(P<0.01)。此外,WT+OVX+HIIT小鼠的血乳酸水平显著高于WT+OVX小鼠(P<0.01)。(3)与WT+Sham相比,WT+OVX小鼠的松质骨BMD、BV/TV、Tb.Th、Tb.N等指标显著降低(P<0.01)。与WT+OVX组相比,WT+OVX+Lac小鼠BMD、BV/TV、Tb.Th、Tb.N等指标均显著升高(P<0.01)。(4)与Gpr81-KO+Sham组相比,Gpr81-KO+OVX小鼠松质骨的BV/TV、BMD、TB.N指标参数明显降低(P<0.01)。与Gpr81-KO+OVX相比,Gpr81-KO+OVX+Lac和Gpr81-KO+OVX+HIIT组小鼠松质骨的BV/TV不存在显著性变化(ns)。与Gpr81-KO+OVX相比,Gpr81-KO+OVX+HIIT组小鼠松质骨BMD、BV/TV水平显著提升(P<0.05),对于Gpr81-KO+OVX+HIIT组小鼠松质骨Tb.Th参数方面无显著性差异(ns)。(5)在体外BMMs定向诱导破骨细胞分化中,来源WT+OVX小鼠的破骨细胞数目和面积显著高于来源WT+Sham、WT+OVX+Lac和WT+OVX+HIIT的小鼠,WT+OVX+Lac和WT+OVX+HIIT组破骨细胞数目和面积无显著性差异。(6)分子机制层面:Gpr81敲除后抑制破骨细胞分化,破骨细胞面积和破骨细胞数量均显著降低(P<0.01),同时Gpr81介导乳酸对破骨细胞分化的抑制作用。与WT+Sham相比,WT+OVX小鼠小鼠Gpr81蛋白的表达不存在显著差异,但是p-p65/GAPDH蛋白的表达量显著升高(P<0.01)。研究结论:(1)Gpr81可以调控小鼠骨量和破骨细胞活性。(2)OVX能够增加小鼠的体重,并引起骨量丢失,HIIT运动能够提高血乳酸水平,并抑制OVX引起的体重增加和骨量丢失。(2)8周HIIT运动干预和体外乳酸注射均能够通过抑制破骨细胞的分化和功能,抑制骨吸收进程,并提高骨密度和骨量。(3)HIIT运动能够引起机体循环水平乳酸浓度的增加,通过激活破骨细胞膜上的乳酸受体Gpr81,抑制胞内下游NF-kB信号通路,从而抑制破骨细胞分化。