目的:骨肉瘤多发于儿童和青少年,其恶性程度高,预后较差。手术切除肿瘤加新辅助化疗是目前骨肉瘤治疗的标准方案,顺铂、阿霉素和甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)是骨肉瘤的一线化疗药物。长期化疗特别是大剂量应用MTX导致的化疗耐药严重影响骨肉瘤患者的预后。因此,寻找新的治疗靶点,探究导致骨肉瘤化疗耐药的内在机制,是改善骨肉瘤化疗耐药问题的关键。自噬是细胞内降解和清除受损的细胞器和错误折叠的蛋白,从而维持细胞内稳态的过程。研究发现,自噬在肿瘤细胞化疗耐药方面具有十分重要的作用,抑制自噬是克服肿瘤细胞化疗耐药的重要策略。叉头盒M1(Forkhead box M1,FOXM1)是一种与细胞增殖相关的转录因子,其广泛参与肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移等生物学性状。研究表明,FOXM1在骨肉瘤细胞中高表达,但其在骨肉瘤细胞对MTX耐药中所起的作用及其机制仍不清楚。本研究旨在探讨FOXM1在骨肉瘤细胞MTX耐药过程中的作用,并进一步探究FOXM1导致骨肉瘤细胞MTX耐药的分子机制。方法:本研究使用两种骨肉瘤细胞系U-2OS、143B和成骨细胞h FOB1.19来探究FOXM1在骨肉瘤MTX耐药中的作用及其分子机制。本研究按照如下思路进行:1.免疫组化和Western blot分别检测骨肉瘤组织和细胞中FOXM1的表达情况;通过TARGET数据库分析FOXM1表达与骨肉瘤患者总生存率之间的关系。2.使用R语言包分析GEO数据库中MTX耐药细胞和敏感细胞中FOXM1的表达情况;通过浓度梯度冲击法建立骨肉瘤MTX耐药细胞,并使用CCK8法检测耐药细胞的IC_(50)值;通过Western blot检测MTX耐药细胞和敏感细胞中FOXM1蛋白的表达。3.使用Western blot和RT-q PCR实验分别检测MTX处理后,骨肉瘤细胞中FOXM1蛋白和m RNA的表达水平。4.使用慢病毒载体构建FOXM1稳定敲低和过表达FOXM1的骨肉瘤细胞,使用Western blot和RT-q PCR实验分别验证转染效率。5.使用CCK-8实验、流式细胞术和Western blot实验检测过表达和敲低FOXM1的骨肉瘤细胞在MTX化疗后细胞的增殖能力、凋亡率和Cleaved-caspase3和Bax蛋白的表达水平。6.使用Western blot和免疫荧光实验检测过表达和敲低FOXM1的骨肉瘤细胞在MTX化疗后细胞内LC3B蛋白的表达情况。7.使用流式细胞术检测过表达FOXMselleck DS-32011的骨肉瘤细胞经MTX和CQ(氯喹,Chloroquine)处理后细胞的凋亡情况。8.使用免疫共沉淀实验检测FOXM1蛋白与HMMR(透明质酸介导的运动受体,Hyaluronan mediated motility receptor)蛋白的相互作用关系;通过Western blot实验检测敲低FOXM1的骨肉瘤细胞中HMMR蛋白的表达情况。9点击此处.使用流式细胞术检测在MTX化疗后,过表达HMMR对敲低FOXM1的骨肉瘤细胞凋亡率的影响。10.通过Western blot实验检测FOXM1参与调控自噬的下游蛋白ATG7(自噬相关蛋白7,autophagy related 7 homolog)的表达情况,以及检测FOXM1与HMMR对ATG7表达的影响。11.裸鼠皮下成瘤实验检测敲低FOXM1的骨肉瘤细胞在体内对MTX敏感性的影响。12.使用TUNEL荧光染色和LC3B免疫荧光染色,检测各组小鼠肿瘤组织中细胞的凋亡情况以及LC3B的表达情况。结果:1.免疫组化结果显示,与癌旁组织相比,肿瘤组织中FOXM1高表达;Western blot结果显示,与h FOB1.19细胞相比,骨肉瘤细胞中FOXM1蛋白表达明显升高;TARGET数据库分析显示,FOXM1的表达与骨肉瘤患者的总生存率呈负相关。2.GEO数据库分析结果显示,耐药细胞中FOXM1表达高于敏感细胞;CCK-8结果显示,耐药细胞的IC_(50)值大于敏感细胞的IC_(50)值4倍,耐药细胞具有耐药性;Western blot结果显示,耐药细胞中FOXM1表达明显高于敏感细胞。3.Western blot结果显示,经MTX处理后,FOXM1蛋白的表达明显升高,且具有浓度依赖性和时间依赖性;RT-q PCR结果显示,经MTX处理后,FOXM1 m RNA的表达水平逐渐升高。4.Western blot和RT-q PCR结果显示,敲低FOXM1和过表达FOXM1的骨肉瘤细胞中FOXM1蛋白和m RNA的表达水平被明显下调和上调。5.CCK-8结果显示,过表达FOXM1增强了MTX化疗后骨肉瘤细胞的增殖能力,而敲低FOXM1降低了MTX化疗后骨肉瘤细胞的增殖能力;流式细胞术结果显示,过表urinary metabolite biomarkers达FOXM1降低了MTX化疗后骨肉瘤细胞的凋亡率,而敲低FOXM1则增加了MTX化疗后骨肉瘤细胞的凋亡率;此外,Western blot结果显示,在MTX化疗后,过表达FOXM1促进了骨肉瘤细胞中Cleaved-caspase3和Bax蛋白的表达水平,而敲低FOXM1则降低了骨肉瘤细胞中Cleaved-caspase3和Bax蛋白的表达水平。6.Western blot结果显示,过表达FOXM1促进了骨肉瘤细胞MTX化疗时的自噬水平,而敲低FOXM1则降低了骨肉瘤细胞MTX化疗时的自噬水平;此外,免疫荧光结果显示,过表达FOXM1增加了MTX化疗时骨肉瘤细胞内LC3B荧光蛋白的表达,而敲低FOXM1则降低了MTX化疗时骨肉瘤细胞内LC3B荧光蛋白的表达。7.流式细胞结果显示,抑制自噬增加了过表达FOXM1的骨肉瘤细胞在MTX化疗后细胞的凋亡率。8.免疫共沉淀结果显示,FOXM1与HMMR存在相互作用关系;Western blot结果显示,FOXM1蛋白正向调控HMMR蛋白的表达。9.流式细胞术结果显示,在骨肉瘤细胞MTX化疗时,过表达HMMR逆转了敲低FOXM1导致的细胞凋亡率增加。10.Western blot结果显示,在骨肉瘤细胞MTX化疗时,敲低FOXM1降低了细胞中ATG7、LC3-Ⅱ蛋白的表达水平,而过表达HMMR后则逆转了ATG7、LC3-Ⅱ蛋白的表达水平。11.裸鼠皮下成瘤实验结果显示,敲低FOXM1的小鼠体内肿瘤的生长速度更慢,肿瘤体积更小,对MTX的敏感性高于对照组。12.肿瘤组织TUNEL染色和免疫荧光结果显示,在同时给与小鼠MTX化疗后,敲低FOXM1的小鼠肿瘤组织中凋亡细胞的比例明显高于对照组,LC3B绿色荧光蛋白的表达低于对照组。结论:FOXM1通过调控HMMR-ATG7轴诱导自噬从而导致骨肉瘤细胞对MTX产生耐药性。这对于MTX耐药的患者来说,使用FOXM1抑制剂可能是解决目前骨肉瘤化疗耐药的一种关键策略。