作为功能性糖的一种,D-甘露糖(D-Mannose)具有诸多有益功能,在食品、医药和化妆品等领域都有广泛的应用。目前制备D-甘露糖的方法有三种,分别为植物提取法、化学合成法和生物酶法,与前两种方法相比,生物酶法具有环境友好、操作简便等优点,已成为制备D-甘露糖的研究趋势。D-甘露糖异构酶(D-ManPF-6463922nose isomerase,D-MIase)、D-来苏糖异构酶(D-Lyxose isomerase,D-LIase)均能催化D-果糖异构化为D-甘露糖,本研究结合结构特征对来源于Escherichia coli DH5α的D-MIase和Bacillus parNSC 127716配制alicheniformis ATCC 9945a来源的D-LIase进行分析比较,经异源表达及酶学表征后进行比较选择,进一步对D-MIase进行理性改造,获得了热稳定性提高显著的突变体,对其展开酶学分析及应用。主要研究内容及结果如下:(1)对D-MIase和D-LIase展开酶学性质分析与比较,结果显示D-MIase的最适反应温度为30℃、最适反应p H为6.0-7.0;D-LIase的最适反应温度为50℃、最适反应p H为7.5,最适金属离子为Mn~(2+)。两者对温度和酸碱的耐受力均展现出较大差异,D-LIase更耐热,对酸性环境敏感;而D-MIase则对碱性环Medical disorder境敏感,耐热性较差。在最适条件下催化合成D-甘露糖,结果显示D-MIase催化下,时空产率和转化率分别达到167 g·L~(-1)·h~(-1)和30.9%,前者为D-LIase催化过程的28倍。D-MIase展现出更为高效的生产能力,具有进一步开发的潜力。(2)利用Discovery Studio虚拟氨基酸突变和Fire Prot策略对D-MIase进行酶活性和热稳定性改造。根据酶活性改造结果,HIS-176、HIS-383和TRP-51为关键活性位点,该位置氨基酸的更改带来酶活的大幅降低。Fire Prot策略预测得到17个热稳定改造热点,通过复筛后确定5个有利突变位点,迭代组合突变后获得最优突变体M4(A241P/A116V/G253A/Q379P)。相比野生酶,M4在50℃的半衰期提高至628.4 min,为野生酶的33倍,相对酶活力也提高了64%,克服了酶活-稳定性平衡(trade-off)问题。(3)对M4进行酶学性质探究,其最适反应温度为45℃,最适反应p H为6.5,与野生酶相比最适反应温度提高了15℃。分子动力学模拟发现,ALA-241和GLN-379位点由于脯氨酸效应,降低了蛋白质去折叠的骨架熵,蛋白质的刚性增加;ALA-116和GLY-253在突变后疏水作用增强,稳定性提高。将WT与M4应用于50℃条件下D-甘露糖的生产制备,结果表明,反应1 h后,M4的转化率和时空产率分别达到29.9%和161.6 g·L~(-1)·h~(-1),与WT相比,M4的转化率提高22.0%,时空产率则为WT的3.8倍。M4的催化效率得到了大幅度提升,具有工业化应用的潜力。