黄瓜(Cucumissativus L.)是我国广泛栽培的主要蔬菜作物之一,其营养丰富,深受消费者喜爱。在与果实有关的品质性状中,果皮颜色是吸引消费者的主要特征之一。黄棕色果皮的黄瓜色泽亮丽,且果皮中黄酮含量高,具有较高的经济价值。前期通过精细定位明确了一个编码MYB的转录因子CsMYB60为控制黄瓜黄棕色果皮的关键基因。本研究在此基础上开展以下研究工作:通过黄瓜转基因明确CsMYB60调控果皮颜色的功能,通过RNA-seq(RNA Sequencing)、酵母单杂交技术(Y1H)等解析CsMYB60调控黄瓜黄棕色果皮的分子机制,以期为黄瓜品质育种提供理论依据。主要研究结果如下:1.黄棕色果皮自交系PW授粉12 days后的果实果皮颜色开始转色,表现为从浅绿色变为棕色。果皮中叶绿素和类胡萝卜素含量在授粉后6-30 d呈下降趋势,而在授粉18 dLEE011溶解度后,总黄酮含量保持较高水平。对不同皮色黄瓜自交系的总黄酮含量测定表明,棕色品种果皮总黄酮含量显著高于浅色品种。2.对PW和绿色果皮自交系Gy2的类黄酮含量测定表明:类黄酮主要存在于果皮中,且PW成熟果实果皮中的类黄酮含量显著高于Gy2。组织特异性表达分析显示,CsMYB60在PW果皮、果肉、果瓤中均有表达,在果皮中表达明显高于其他组织。基因时序表达比较分析表明,CsMYB60在授粉后12 d的PW果皮中表达水平最高且显著高于Gy2。3.与成熟果皮为绿色的野生型XTMC(White Typle,WT)相比,CsMYB60过表达株系的成熟果皮呈现棕色。在过表达株系中CsMYB60表达量在果皮中显著高于其在果肉和果瓤中的表达量。黄酮含量测定表明:CsMYB60过表达株系的成熟果皮中总黄aviation medicine酮含量显著高于野生型。4.基因克隆及序列比对发现:在Gy2中,CsMYB60的第二个外显子中有一个C(棕色果皮品种中的CGA/Arg,CsMYB60c)到T(绿色果皮品种中的TGA/StopCsMYB60t)的单碱基非同义突变,这一突变导致Gy2中CsMYB60编码序列发生变化,蛋白翻译提前终止,导致Gy2果皮呈现绿色。在浅黄色果皮黄瓜材料CsMYB60的第二个内含子区域有一个6994 bp的插入片段,阻碍了CsMYB60表达。通过3’RACE克隆发现:浅黄色果皮黄瓜中CsMYB60形成了一个新的转本,全长cDNA为1,291 bp,编码蛋白长度仅为97个氨基酸,命名为CsMYB60i。亚Alisertib生产商细胞定位研究发现:CsMYB60蛋白分布于细胞核。基于酵母表达实验,鉴定出CsMYB60c蛋白在酵母中具有转录活性,属于转录激活因子,转录激活结构域在C端,使得果皮颜色呈现黄棕色,而CsMYB60t和CsMYB60i不具有转录活性,使得分别呈现绿色和浅黄色果皮。5.通过比较野生型和CsMYB60过表达株系果皮的RNA-seq数据及生物信息学分析,共检测到1496个差异表达基因。KEGG富集分析显示,与类黄酮生物合成(ko00941)相关的通路受到CsMYB60过表达的显著影响。Y1H、烟草瞬时转化结果表明,CsMYB60c能够结合CsF3’H的启动子,然而CsMYB60t或CsMYB60i与不能与CsF3 ‘H启动子结合。6.基于UPLC-ESI-MS/MS方法对野生型和过表达株系果皮的类黄酮代谢产物进行了分析,共鉴定出18种类黄酮代谢物具有显著差异,其中金丝桃苷是果皮中最主要的黄酮类化合物。