目的:本media campaign研究旨在探讨circRNA ASXL1(circASXL1,hsa＿circ＿0001136)在内皮细胞铁死亡中的功能及其对动脉粥样硬化的调控机制,为进一步阐明动脉粥样硬化的发病机制提供理论基础和实验依据,建立更为完善的精准治疗方案和诊疗标准。方法:(1)通过文献调研发现circASXL1在内皮细胞中高表达,并采用circbase网络公共数据库(http://circbase.org/)检索circASXL1的成熟序列和circ Interactome网络公共数据库(https://circinteractome.nia.nih.gov/)设计circASXL1正反引物(F:5’-TAAACTGCCTGGCCGAATC-3’,R:5’-TCCTTCTGCCTCTATGACCTG-3’)。(2)收集动脉粥样硬化患者的外周血检测circASXL1的表达。经查阅文献及实验确定分别使用0-2.5μM浓度范围内的铁死亡激活剂Erastin和0-20 ng/ml浓度范围内的TNF-α处理人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECVE-822s)构建铁死亡细胞模型和动脉粥样硬化细胞模型,并通过qRT-PCR技术分别检测circASXL1在两种模型中的表达情况。(3)接着,通过一代测序及PCR技术进一步鉴定circASXL1是否成环,而且通过FISH技术确定circASXL1的亚细胞定位。(4)为了验证HUVECs是否存在铁死亡,将处于对数期的HUVECs分别暴露于不同浓度(0-2.5μM)的Erastin和不同浓度(0-20 ng/mL)的TNF-α,继续培养细胞24小时,活性氧检测试剂盒检测ROS水平,MDA检测试剂盒检测MDA水平,qRT-PCR检测铁死亡特异性基因PTGS2、FTH1、GPX4。(5)通过Western Blot技术检测铁死亡特异性蛋白PTGS2、GPX4的表达情况,进一步确定细胞存在铁死亡。(6)为了探索circASXL1引起HUVECs铁死亡,构建circASXL1过表达载体,并采用qRTPCR技术验证其在HUVECs中的表达效率。在HUVECs中转染过Roxadustat采购表达载体后,继续培养细胞24小时后,使用活性氧检测试剂盒检测ROS水平,MDA检测试剂盒检测MDA水平,利用qRT-PCR技术检测铁死亡特异性基因PTGS2、FTH1、GPX4的表达情况。(7)通过Western Blot技术及细胞黏附实验分别检测HUVECs粘附分子VCAM-1、ICAM-1的表达变化及其粘附性的改变。(8)采用Western Blot技术检测HUVECs中炎症因子IL6、IL-1β表达的变化情况。(9)为了探索circASXL1的下游靶标,利用Circ Interactome数据库、miRDB数据库和Ferr Db数据库预测了circASXL1的下游靶标,通过qRT-PCR实验进一步确定。结果:(1)CircASXL1在HUVECs中表达,并在Erastin和TNF-α的刺激下表达上调。(2)CircASXL1在HUVECs中为环状RNA,成环位点为第81位和82位碱基处。CircASXL1在HUVECs的亚细胞结构定位为细胞质与细胞核。(3)暴露于Erastin和TNF-α后,HUVECs中的ROS、MDA的生成量呈浓度依赖性的上升,铁死亡特异性基因PTGS2呈浓度依赖性的上升,FTH1、GPX4呈浓度依赖性下降。铁死亡特异性蛋白PTGS2表达升高,GPX4表达下降。(4)过表达circASXL1后,HUVEC中ROS、MDA的生成量较对照组升高,铁死亡特异性基因PTGS2的表达升高,FTH1、GPX4的表达下降。(5)暴露于TNF-α和Erastin后,HUVECs粘附分子表达量增加,且粘附能力增强。(6)暴露于TNF-α和Erastin后,HUVECs炎症因子表达量呈浓度依赖性的方式增加。(7)CircASXL1的miRNA分子海绵为hsa-miR-767-3p,且hsa-miR-767-3p的预测下游靶标为CHAC1。结论:本研究发现CircASXL1有可能通过hsa-miR-767-3p/CHAC1通路促进内皮细胞铁死亡,引起内皮细胞功能障碍,导致动脉粥样硬化的发生。