肌萎缩性侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一类非常致命的神经退行性疾病,其主要特征是上下运动神经元功能异常和变性,从而导致肌肉萎缩、瘫痪,并在初次确诊的3～5年因呼吸衰竭死亡。其中TAR DNA结合蛋白43(TAR DNA binding protein 43,TDP43)以及超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)突变为主要致病因素。突变体SOD1的表达导致蛋白酶体活性降低并抑制自噬,从而导致突变、损伤和错误折叠的蛋白积累,并导致线粒体和内质网应激等。TDP43过表达或突变会导致其错误定位诱发毒性,形成胞质内TDP43包涵体以及核内正常TDP43缺失,并破坏线粒体功能,造成神经元和轴突损伤。目前,尚未发现能够治愈或者逆转ALS疾病的治疗方法,并且ALS的发病机制仍不清晰,因此,探究ALS的发病机制十分重要。Bax抑制蛋白1(Bax Inhibitor-1,BI1)是内质网跨膜蛋白可抑制Bax调节凋亡。自噬与外泌体均可以参与错误折叠蛋白的清除,从而发挥解毒和神经保护功能。另外,线粒体内质网结构偶联(mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane,Mluciferase immunoprecipitation systemsAM)参与并调节自噬的形成。据研究报道BI1具有一定的神经保护作用,但具体机制尚不清晰。因此,探究BI1参与自噬的启动并促进病理性蛋白降解的机制进而抑制细胞凋亡十分重要,并为治疗ALS等神经退行性疾病提供了一条潜在的治疗途径本研究主要探究BI1对SOD1~(G93A)诱导的细胞凋亡以及线粒体异常的影响,以及相关机制,研究内容包括:(1)建立稳定过表达B-NSC-34细胞系,利用Western-Blot、TUNEL、CCK-8以及透射电镜观察细胞核变化来探究BI1对SOD1~(G93A)诱导细胞凋亡的影响;(2)通过JC-1、轴突染色、透射电镜观察线粒体以及MAM变化检验进一步探究BI1对SOD1~(G93A)诱导的线粒体异常的影响;(3)利用透射电镜、活性氧检测(Reactive Oxygen Species,ROS)、Western-Blot、免疫荧光互作探究在这一过程中BI1与自噬的相关机制。实验结果显示:(1)BI1过表达后,细胞凋亡程度减弱等,另外BI1能够抑制SOD1~(G93A)诱导的TDP43(43 KD)从细胞核转移至细胞质,并且降低TDP43在线粒体中的水平,抑制细胞色素C(Cytochrome C,Cyto-C)的释放以及BAX转移至线粒体。(2)JC-1、Tubulin和透射电镜结果显示BI1能够抑制SOD1~(G93A)诱导的线粒体膜电位异常下降和线粒体损伤,缓解MAM的间隙增大以及保护神经轴突的完整性。(3)Western-Blot发现BI1可上调LC3B、Beclin1的表达量,TDP43(43 KD)的降解也有所缓解,并能显著抑制ROS的生成;BI1过表Smoothened Agonist化学结构达后,相比于SOD1~(G93A)组,BI1和TDP43相互作用明显增强,Bax和TDP43的作用减弱,同时BCL-2和Bax的结合显著增强,BCL-2和Beclin1的结合明显减弱,MFN2、Beclin1和TDP43相互作用稍有增强;并发现在外泌体中含有BI1蛋白,同时BI1过表达后外泌体中的病理性TDP43的水平下降。在B-NSC-34细胞中添加外泌体抑制剂后,Beclin1和LC3B的水平显著上调,并且GRP75和MFN2的表达也增加,TDP43(35 KD)降低。综上所述,本selleckchem RAD001文所得结论如下:(1)BI1抑制SOD1~(G93A)诱导的NSC-34中Cyto-C的释放、BAX的转运及TDP43的核逆转、线粒体异常以及细胞凋亡。(2)BI1能够激活自噬并降低SOD1~(G93A)诱导的活性氧水平,并且能够通过Bax和BCL-2以及TDP43和Beclin1的竞争性结合破坏Beclin1与BCL-2的相互作用增强自噬从而抑制凋亡。(3)同时BI1与TDP43相互作用间接降低TDP43与Bax的相互作用从而抑制细胞凋亡,并且抑制TDP43(43 KD)降解以及病理性TDP43在外泌体中的传播。总之,BI1可激活自噬从而缓解TDP43的降解、抑制线粒体异常、细胞凋亡从而维持细胞稳态,以及BI1对病理性TDP43在外泌体中的传播抑制缓解ALS进展。以上研究为探索BI1在自噬与外泌体治疗ALS等相关神经退行性疾病的作用提供了有力依据,为临床应用与开发提供了新途径。