背景随着免疫抑制剂的广泛使用和临床重症感染病人的增加,全世界的真菌感染发病率逐年上升,尤其是以白念珠菌感染为首的侵袭性念珠菌病,因此在临床上防治白念珠菌侵袭性感染至关重要。目前,临床上可用的抗真菌药物数量十分有限,而且长期使用抗真菌药物易导致真菌耐药性产生。白念珠菌属于真核细胞,与哺乳动物细胞多有相似之处,因此大多数抗真菌药物对人体具有毒副作用,这也使得抗真菌药物研发进程缓慢,临床迫切需要研发新的有效的抗耐药性的药物。目的研究双吲哚甲烷苯酚衍生物BI-10与氟康唑联用对白念珠菌的体内外抗菌活性及其潜在的机制。方法1.体内外活性评价:微量稀释法、生长曲线测定BI-10联合氟康唑对白念珠菌的体外抗菌效果;建立大蜡螟真菌感染模型,进一步确定BI-10联合氟康唑的体内抗菌活性。2.机制研究:对耐药机制的研究:采用Rh6G测定药物对白念珠菌的外排功能,采用q RT-PCR法对耐药相关基因进行检测,结晶紫染色法和XTT/甲萘醌溶液法对生物膜的影响;对白念珠菌毒力特征的研究:通过倒置显微镜和扫描电镜观察菌丝生长情况,q RT-PCR法检测菌丝相关通路Ras1/c AMP/PKA基因的表达,添加外源性c AMP进行验证;对白念珠菌脂滴生成的研究:通过透射电镜观察菌内结构,脂滴特异性染料尼罗红染色观察胞内脂滴数量,基于LC-MS/MS定量脂质组学测定差异脂质含量变化,q RT-PCR法测定脂滴合成相关通路基因的表达;对白念珠菌蛋白质组学的研究:通过Label-free蛋白质组学分析差异蛋白表达情况,Seahorse XFe24检测白念珠菌的胞外酸度(ECAR),采用化学发光法测定白念珠菌内ATP含量,荧光探针测定活性氧及线粒体膜电位水平。结果1.BI-10与氟康唑联用在体外对白念珠菌敏感株和耐药株均具有较强的抗菌活性,药物联合对大蜡螟幼虫真菌感染模型也具有抗菌作用,主要表现在提高大蜡螟幼虫的生存率,减少虫体内白念珠菌的数量。2.BI-10与氟康唑联用对白念珠菌的外排泵和生寻找更多物膜无明显的抑制作用,能下调CDR2和MDR1基因的表达,但上调CDR1和ERG11基因的medical crowdfunding表达。3.BI-10联合氟康唑能抑制白念珠菌由酵母到菌丝的形态转换,并显著下调Ras1/c AMP/PKA信号通路中RAS1、CYR1、EFG1、ECE1、ALS3和HWP1基因的表达水平,通过添加外源性c AMP能部分恢复药物联合对菌丝生长的抑制作用。4.BI-10与氟康唑联用能诱导白念珠菌内脂滴的大量生成,提高了细胞内整体脂质水平,特别是脂滴的主要成分甘油三酯(TG)的含量显著上升,还上调了脂滴合成通路FAS2、ACC1、LRO1、ARE2、AYR1及CDS1基因的表达。5.蛋白质组学结果显示,亚细胞定位结果表明差异蛋白主要定位于细胞核和细胞质;GO功能富集图显示差异蛋白主要聚集在细胞代谢过程和碳水化合物代谢过程等生物学过程,以及细胞的胞质部分、细胞膜部分、核糖体等细胞过程;KEGG通路分析发现差异蛋白主要集中在核糖体翻译过程、碳水化合物过程、脂质代谢等过程,进一步分析发现显著下调糖酵解途径和上调脂质代谢过程相关酶。6.细胞能量代谢机制验证发现,BI-10与氟康唑联用降低白念珠菌的基础糖酵解、最大糖酵解能力及糖酵解储备能力。此外,药物联合抑制胞内ATP含量,升高活性氧水平,降低线粒体膜电位。结论双吲哚甲烷苯酚衍生物BI-10与氟康唑联用在体内外均具有良好的抗白购买GSK1349572念珠菌活性,能降低白念珠菌的毒力和致病性。其作用机制可能是:一方面,通过抑制糖酵解途径,降低胞内ATP的合成,下调Ras1/c AMP/PKA信号通路而抑制白念珠菌菌丝的形成。另一方面,破坏线粒体功能导致大量脂滴的形成,影响了白念珠菌的脂质代谢和能量代谢,从而发挥抗真菌的作用。