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植物小分子信号肽（small signaling peptides, SSPs）是一类蛋白长度小于120个氨基酸的小Genetic characteristic肽，作为新型信号分子在植物应答非生物逆境胁迫中发挥重要的作用。植物中含有千余种SSPs，多种多样的结构特点、修饰过程与不同受体的结合发挥其特异的功能，参与植物与环境之间的互作。挖掘鉴定植物SSPs功能基因，解析它们应答非生物逆境胁迫的调控更多机制，对增强植物抗性、改善植物生长具有重要的理论与实践意义。植物SSPs主要包括胞外非分泌型小肽、胞内非分泌型小肽、胞外翻译后修饰分泌型小肽和胞外富含半胱氨酸分泌型小肽四大类。介绍了四类植物SSPs的结构、特征；阐述了它们以SSP配体结合LPF-02341066配制RR-RLK受体激酶完成信号转导过程，以激活下游抗性基因表达为模式的调控机制；重点综述了它们在干旱、高温、盐渍、营养等非生物逆境胁迫应答中的生物学功能及调控机制。最后讨论了植物SSPs未来研究的方向和有待解决的问题，还对SSPs类生长调节剂的开发前景进行了展望，旨在为提高植物应对环境胁迫和实现农业可持续发展提供新的思路和路径。

植物对病原微生物的防御分为两个层次,病原相关分子模式(PAMP)触发免疫(PTI)和效应子触发免疫(ETI),分别由细胞表面模式识别受体(PRRs)和细胞内核苷酸结合/富亮氨酸重复受体(NLRs)介导。植物的先天免疫能够对抗各种不断进化的病原体。ETI是植物免疫的主要方式。CPR5是一个关键的植物免疫负调节因子。cpr5突变体具有自主激活免疫系统的表型,主要表现为子叶提前衰老,水杨酸含量升高以及抗病基因(PRs)组成性表达。已有的研究表明CPR5蛋白定位于核孔,通过调控核质运输和细胞周期参与植物免疫。有趣的是非洲稻两个CPR5基因中的一个拷贝突变,提高了植物的抗病性。cpr5突变体具有自主抗病的表型,这为培育改良作物新品种提供了很好的理论依据,对农业生产具有十分重要的意义。在此我们报告了CPR5蛋白新的免疫调控机制,它通过NTC和CPSF两大RNA加工复合体参与植物免疫的调控。(1)为了进一步解析CPR5蛋白的功能,我们通过EMS诱变剂处理cpr5突变体,成功筛选到两个回复子cpr5 scpr44和cpr5 scpr57。通过DNA-seq分析和回补验证成功克隆了回复子基因PRL1和FIP1。(2)通过突变体杂交,得到cpr5 prl1 fip1三突变体,进一步通过离子泄漏、细胞程序性死亡(PCD)、PR基因表达以及病原菌侵染发现,prl1 fip1双突变体中免疫反应受到的损伤比单突变体prl1和fip1更加严重。这些数据表明PRL1和Fselleck BemcentinibIP1以及它们所在的NTC和CPSF复合体位于CPR5蛋白的下游,协同激活植物PCD和免疫。(3)通过RNA-seq分析发现,cpr5突变体中差异表达基因(DEGs)和cpr5prl1 fip1诱导的DEGs有36.82%重叠,表明CPR5中DEGs调控是依赖于PRL1和FIP1,这些数据表明PRL1和FIP1蛋白协同参与CPR5信号途径,共同激活植物免疫系统。(4)通过酵母双杂交(Y2H)、免疫共沉淀(Co-IP)、双分子荧光互补(Bi FC)和荧光共振能量转移(FRET-FLIM)实验发现,CPR5蛋白可以与PRL1和FIP1蛋白在细胞核上相互作用,共定位于具有RNA加工功能的无膜细胞器——核斑点。(5)通过对CPR5蛋白序列分析发现其N端具有丝氨酸/精氨酸富集(SR)结构域,在数据库中检索发现CPR5蛋白和RNPS1、SR45、SR45a蛋白都具有SR结构域,而通过蛋白同源性结构域比较发现,CPR5蛋白和果蝇Tra2、人类RNPS1以及拟南芥SR45和SR45a相似selleck产品,具有两个保守的RNA识别结构域——RNP1和RNP2。通过保守结构域SR-RRM的功能替换互补实验发现,RNPS1、SR45和SR45a蛋白的SR-RRM结构域可以完全代替CPR5蛋白的SR-RRM结构域。这些数据表明CPR5蛋白是SR家族的RNA结合蛋白。(6)通过对RNA-seq数据深入分析,和WT相比,cpr5突变体中的RNA可变剪接具有明显的差异性,我们通过RT-PCR实验验证了这些RNA剪接的差异性结果。这些结果表明了CPR5蛋白调控pre-m RNA的可skin microbiome变剪接。(7)最后我们通过RNA的凝胶迁移率(EMSA)实验和RNA蛋白免疫共沉淀(RIP)实验证明了CPR5蛋白具有RNA结合活性。以上研究表明CPR5蛋白是SR家族RNA结合蛋白,通过RNA剪接因子NTC和poly(A)加尾因子CPSF调控植物免疫。结合我们实验室之前的发现,我们的研究揭示了CPR5将核质运输、细胞周期和RNA加工三大基本生命过程整合在一起调控植物免疫,为我们对植物免疫机制的了解提供了新的思路,培育新的作物品种提供了新的科学依据。

端粒位于异染色质的末端,是由一些简单的短DNA重复序列和特殊识别的蛋白质所组成。作为一种典型的异染色质结构,端粒在对于维持染色体稳定性和控制细胞分裂周期中起着重要作用。除此之外,端粒还在细胞响应DNA损伤以及延缓细胞衰老等方面也发挥着重要功能。研究发现,端粒长度以及结构在一定条件下会受到细胞代谢水平的调控。越来越多的研究成果表明,组蛋白翻译后修饰对于端粒沉默的调控也是至关重要的。作为一种非常重要的翻译后修饰,组蛋白H3苏氨酸11(H3T11)磷酸化调控许多重要的细胞生命过程。SESAME复合体中的丙酮酸激酶Pyk1催化的H3T11磷酸化(H3p T11)能够通过调节端粒沉默蛋白Sir2的表达来维持端粒沉默。在酿酒酵母中,丝氨酸/苏氨酸磷酸酶Glc7被鉴定出能够去H3T11磷酸化,然而对于磷酸酶Glc7在调控端粒沉默的研究上,更多的是其与端粒蛋白形成复合物作为催化亚基发挥作用,但Glc7是否受到其他修饰酶的调控以及如何发挥其磷酸酶的功能是未知的。端粒沉默受到多种翻译后修饰的调控,很多报道表明这些翻译后修饰是独立发挥作用的,然而,越来越多的研究表明,组蛋白翻译后修饰之间存在组合调控,也就是两个或者多个不同氨基酸上发生的修饰之间也能存在翻译后修饰之间的串扰,对于组蛋白H3p T11是否与其他翻译后修饰之间存在串扰并发挥功能还是鲜少见到的。我们用酿酒酵母作为研究对象,筛选与磷酸酶Glc7存在物理相互作用的其它修饰酶,研究这种存在相互作用的修饰酶以及其影响的组蛋白翻译后修饰之间的串扰在端粒异染色质调控中的功能。磷酸酶Glc7与乙酰转移酶SAS复合物存在物理相互作用,Sas2能够抑制Glc7与组蛋白的相互作用,使H3p T11水平降低。除此之外,我们分析Ch IP-sePD-0332991 NMRq发现组蛋白H3p T11与H4赖氨酸16(H4K16)乙酰化的分布呈现相反的趋势。Sas2能够调控Glc7与H3p T11在端粒以及自噬基因上的结合。总之,我们的研究为通过从调控修饰酶活性出发找寻修饰酶互作以及组蛋白翻译后修饰之间的串扰来动态调控端粒沉默与细胞自噬提供了重要的线索。具体研究结果如下:1.磷酸酶Glc7与乙酰转移酶Sas2存在物理相互作用。通过大量的免疫共沉淀筛选,我们找到了与Glc7存在相互作用的修饰酶Sas2。通过蛋白免疫沉淀Sas2检测Glc7和免疫沉淀Glc7检测Sas2,以及酵母细胞点平板实验,最终确定Glc7确实与Sas2存在相互作用。2.SAS复合物催化的H4K16乙酰化抑制H3T11磷酸化的表达。我们分析了Ch IP-seq数据,发现H4K16ac与H3p T11的分布呈现很强的负相关性。然后在突变体glc7-ts,以及H3T11A和H3T11D中检测了H4K16ac的表达,发现H4K16ac水平不变。之后在突变体sas2Δ、sas4Δ和sas5Δ中检测H3p T11,发现H3p T11水平明显升高,但Glc7的转录和蛋白水平都无明显变化。在乙酰化失活突变体H4K16A和H4K1此网站6R中同样观察到H3p T11水平显著升高。综上,我们发现SAS复合物催化的H4K16ac能够抑制H3p T11,但不影响与之相互作用的磷酸酶Glc7的水平。3.Sas2催化的H4K16ac促进Glc7与组蛋白的结合。我们纯化大肠杆菌表达的Glc7-HIS蛋白,在体外做组蛋白免疫共沉淀(HIP)实验,通过Western blots检测Glc7与组蛋白H3、H4、H2A和H2B之间的相互作用,发现在突变体sas2Δ和H4K16R中Glc7与组蛋白的结合明显降低,通过这种方式抑制H3p T11的水平。4.Sas2促进Glc7在自噬基因与端粒基因的结合。我们已经证明了Sas2与Glc7存在相互作用,并且H4K16ac和H3p T11的分布呈相反趋势,接着应用Ch IP-q PCR技术,在突变体sas2Δ中Ch IP:Glc7,我们发现Glc7在自噬基因与端粒基因上的结合都明显降低。说明Sas2能够特异性的招募Glc7结合到端粒基因上,从而破坏端粒沉默。5.Sas2抑Laboratory biomarkers制H3p T11在自噬基因与端粒基因的结合。Glc7是酵母中去H3T11磷酸化的磷酸酶,为了证明Sas2招募Glc7调控端粒沉默和自噬是不是通过其去磷酸化的功能来实现的,我们通过Ch IP-q PCR技术在突变体sas2Δ中检测了H3p T11在自噬基因和端粒基因上的结合,发现与Glc7结合相反,H3p T11在自噬基因和端粒基因上的结合下降。根据上述研究,我们的结果表明磷酸酶Glc7与乙酰转移酶SAS复合物存在相互作用;Sas2通过抑制Glc7与组蛋白的结合从而使H3p T11水平降低;并以端粒沉默与细胞自噬为切入点,对Sas2作为乙酰转移酶对磷酸酶Glc7的调控机制进行了研究,Sas2通过促进Glc7在自噬基因和端粒基因上的结合进而影响H3p T11来调控基因沉默,也表明了两种组蛋白翻译后修饰H4K16ac与H3p T11在端粒沉默调控过程中的串扰。总的来说,我们的研究发现了两种组蛋白修饰酶互作以及其影响的翻译后修饰之间的串扰在端粒异染色质调控以及细胞自噬中的作用。对调控H3T11磷酸化的机制进行研究对于端粒异染色质的调控进而延缓细胞衰老等都是极其重要的。

为开发绣球功能基因多态性SSR分子标记，本研究以‘安娜贝拉’绣球花盛花期花朵为试验材料，对其萼片进行Illumina高通量测序，经过系列分析得到Unigene，使用MISA对得到的Unigene进行SSR挖掘和筛选，利用Primer premier 5.0软件进CB-839行SSR引物设计，以得到SSR位点分布信息、出现频率等。结果表明，在122 490条Unigenes中发现43 612条分布有SSR位点，共检测到71 884个SSR位点，平均分布长度为1 510.92 bp。在所有SSR位点Akt抑制剂中，二核苷酸和单核苷酸重复的数量最多，分别为32 971个(45.87%)和32 011个(44.53%)。71 88Joint pathology4个SSR位点共包含175种基序类型，重复次数范围为5～84次，且大部分集中在6～12次，有18.85%的SSR位点基序长度大于20 bp，另外重复基序为A/T、AG/CT、AT/AT、AC/GT、AAG/CTT和ACC/GGT的位点是优势位点，数量均大于1 000。本研究为绣球多态性SSR标记的筛选和利用提供参考。

目的 分析噬血性淋巴组织细胞增生症(hemophagocytic lymphohistiocdeep sternal wound infectionytosis, HLH)病因、发病机制及诊治。方法 回顾性分析2016年1月～2022年1月黑龙江省医院26例成人HLH患者的临床资料，分析病因构成、临床特征、实验室结果、治疗反应及临床转归。结果 26例成人HLH患者中淋巴瘤相关性8例，感染相关性8例(其中6例为INCB018424纯度EB病毒相关性),风湿免疫相关性5例。在临床及实验室检查方面，26例患者均有发热；肝肿大2例，占7.7%;脾肿大17例，占88.5%;淋巴结肿大14例，占73.1%;皮肤损害5例，占19.2%。2系或3系血细胞减少18例，占88.5%;高甘油三酯血症15例，占57.7%;低纤维蛋白原血症11例，占42.3%;骨髓涂片和(或)活检可见噬血现象20例，占76.9%;自然杀伤(natral kill, NK)细胞活性减低13例，占50.0%;sCD2更多5水平升高20例，占100%;血清铁蛋白水平高于500μg/L 24例，占92.3%。主要参照HLH-1994或HLH-2004方案治疗，中位随访14个月(2～24个月),中位总生存时间未达到，1例失访，已死亡8例。结论 成人HLH可由多种病因所致，涉及多学科疾病。早期诊断及明确病因并积极治疗对HLH预后具有重要意义。

小麦茎基腐病和纹枯病是生产上常见的两种土传病害,由于秸秆还田、高密度种植等耕作措施的实施和推广,近年来我国小麦茎基腐病和纹枯病的发病率和严重程度呈上升趋势,严重威胁小麦的产量和品质。目前,国内外小麦茎基腐病和纹枯病抗性种质资源匮乏,抗病基因的挖掘较少,抗病机制研究不够深入等问题都严重制约着小麦茎基PD-0332991体外腐病和纹枯病的遗传改良研究。植物代谢物在人类健康和植物自身生长方面都发挥着重要作用,随着技术的不断发展,植物代谢组研究已经取得了一定的进展,然而在小麦籽粒代谢物的自然变异和遗传调控研究方面都尚未取得较大的进展。本研究主要利用全基因组关联分析(GWAS)和数量性状定位(QTL)等遗传学方法,以及中国春基因组数据库、小麦660K SNP芯片、转录组测序、重测序和广泛靶向代谢组(LC-MS/MS)等技术方法,研究与小麦茎基腐病和纹枯病抗性以及籽粒代谢物相关的问题。本研究的主要结果如下:1)通过混池转录组分析、重测序结果、茎基部表达量、受菌诱导情况以及病毒诱导基因沉默等方式,挖掘到一个注释信息为细胞壁转化酶的基因(Ta CWI-B1)可能与小麦茎基腐病抗性相关。对Ta CWI-B1在来自于黄淮海地区的446份小麦材料中的多态性进行单倍型分析,结果表明主要形成3种单倍型,其中Ta CWI-B1＿Hap1(Ta CWI-B1)为抗病单倍型,Ta CWI-B1＿Hap2、3为感病单倍型,进一步通过构建两个F_6重组自交系群体验证了Ta CWI-B1＿Hap1的抗病作用。通过突变和过表达Ta CWI-B1＿Hap1的方式验证了其正向调控小麦茎基腐病。根据Ta CWI-B1的不同单倍型序列,开发了一个d CAPS标记,能够有效的区分Ta CWI-B1＿Hap1和Ta CWI-B1＿Hap2、3。2)对Ta CWI-B1的突变体和过表达小麦植株的茎基部进行组织学以及细胞壁成分分析。结果表明与对应野生型小麦植株相比,突变Ta CWI-B1使植株茎基部细胞壁变薄,果胶和纤维素含量显著下降;过表达Ta CWI-B1使植株茎基部细胞壁增厚,果胶和纤维素含量显著上升。通过酵母双杂交和双荧光素试实验验证了Ta CWI-B1能够与一个注释信息为α-半乳酸糖苷酶(Ta GAL)的蛋白互作。进一步利用q RT-PCR证明了Ta CWI-B1能够抑制Ta GAL的表达,且通过Ta GAL的突变体验证了其能够负向调控茎基腐病。3)为进一步验证Ta CWI-B1基因对土传病害是否有广谱抗性,对44Defensive medicine6份小麦材料、两个F_6重组自交系群体、Ta CWI-B1突变体和过表达材料、Ta GAL的突变体小麦植株的纹枯病抗性进行了鉴定,发现具有Ta CWI-B1＿Hap1基因型的小麦植株更抗小麦纹枯病,具有Ta CWI-B1＿Hap2、3基因型的小麦植株更感小麦纹枯病;与野生型植株相比,Ta CWI-B1的突变体小麦植株纹枯病抗性减弱,而Ta CWI-B1过表达小麦植株纹枯病抗性增强,Ta GAL的突变体小麦植株的纹枯病抗性增强。4)利用LC-MS/MS技术对来自于黄淮海地区的349份关联群体材料和由咸阳大穗/新麦26(XX＿RIL)构建的F_(10)代包含138个重组自交系的材料进行了籽粒代谢物种类和含量的检测分析。共鉴定到947种代谢物,其中159种代谢物能够直接通过标准品直接确定,302种代谢物能够推测出信息,其余的为未知物质。对关联群体材料的籽粒代谢物含量进行变异系数(Coefficient of variation,CV)分析,结果表明代谢物含量在不同小麦品种间具有较大的差异。利用代谢物全基因组关联分析(Metabolites genome-wide association analysis,m GWAS)和代谢物数量性状定位(Metabolites quantitative trait loci,m QTL)的方法和小麦660K SNP芯片对鉴定到的947种代谢物进行m GWAS和m QTL分析。其中m GWAS共定位到分布在全基因组上的33,566个显著性SNP(P<0.0001);通过m QTL共定位到3804个QTL(LOD≥2.5),结合m GWAS和m QTL定位到的位点及区间,发现其中94种代谢物能够共同定位在同一区间内,进一步分析发现了一个能够同时影响13种与色氨酸代谢通路相关的代谢物的候选基因Traes CS7A03G0128100。5)对33个籽粒性状进行了表型全基因组关联分析(Phenotype genome wide association analysis,p GWAS),共定位到了22,099个显著性SNP位点(P<0.0001)。结合m GWAS、p GWAS和m QTL的分析结果发现了1799个SNP能够被共同定位到。进一步分析结果证明Traes CS4A02G343700基因能够影响籽粒圆度(Roundness)与赤霉素A4(Gibberellin A4,GA4)含量,该结果需要进一步通过突变体、转基因、基因编辑等方式去验证该候选基因的STM2457核磁相关功能。由于目前小麦茎基腐病和纹枯病抗性基因和抗性机制以及小麦籽粒代谢组研究的缺乏,本研究发现的Ta CWI-B1能够通过降低Ta GAL的表达来增加小麦植株茎基部的细胞壁的厚度而提高了小麦植株对茎基腐病和纹枯病的抗性,为小麦抗茎基腐病和纹枯病病育种提供了遗传基础和基因资源。同时本研究构建了一个广泛的代谢物种类库,并进一步解析了代谢物调控网络,发现了一些能够影响代谢物含量来改变籽粒相关性状的基因,表明通过代谢组学解析复杂农艺性状的可行性。

目的 探讨球囊扩张联合Solitaire支架对伴动脉粥样硬化急性颅内大血管闭塞患者血管开通与病情转归的影响。方法 选取2016年1月—2022年5月太原钢铁(集团)有限公司总医院神经内科收治伴动脉粥样硬化急性颅内大血管闭塞患者82例，随机数字表法分为对照组和观察组，每组41例。对照组采取Solitaire支架治疗，观察组采用球囊扩张联合Solitaire支架治疗。观察2组手术相关指标、血管再通情况、术前及术后3 d脑血流灌注[相对脑血流量(rCBF)、相对达峰时间(rTTP)、相对平均通过时间(rMTT)、相对脑血容量(rCBV)]、血管内皮功能[血管假性血友病因子(vWF)、内皮素-1(ET-1)、一氧化氮(NO)]、术前及出院时昏迷风险(GCS评分)、神经功能缺损程度(NIHSS评分)、认知功能(MOCA评分)及并发症。结果 观察组取栓次数少于对照组，术后即刻血管内径大于对照组(t/P=5.162/<0.001、3.446/0.001);观察组血管再通率与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05);术后3 d观察组rCBF水平高于对照组，rMTT、rTTP水平低于对照组(t/P=2.217/0.029、4.714/<0.001、4.919/<0.001);观察组术后3 d血清vWF、ET-1水平低于对照组，NO水平高于对照组(t/P=6.770/<0.001、12.292/<0.001、8.726/<0.001)periprosthetic infection;观察组出院时GCS、MOCA评分高于对照组，NIHSS评VX-661分低于对照组(t/P=3.326/0.001、6.163/<0.001、10.584/<0.001);观察组并发症总发生率与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结论 球囊扩张联合Solitaire支架用于治疗伴动脉粥样硬化急性颅内大血管闭塞患者，能减少取栓次数，INCB018424 IC50增加血管内径，改善血管内皮功能，有助于脑血流灌注，促进病情转归，且安全性较高。

不可控制性大出血是导致战时或平时各种突发意外事故及创伤性死亡的重要原因。据报道,由各种不可控失血导致的死亡人数占各种突发创伤意外死亡人数的31%,而战场上更是有超过50%的死亡是由不可控制大出血造成的。因此,积极控制战现场大出血,为伤员后送争取宝贵救治时间,是有效降低我军战伤死亡率的重要手段。局部止血敷料及便携式止血装置是战现场及院前急救止血最主要的救治手段,针CB-839对新型止血材料和便携式止血装置的研究一直是战创伤救治领域的研究热点。壳聚糖是一种有着良好生物相容性的天然止血材料,其主要止血机制是具有大量游离氨基阳离子,容易与红细胞上所带负电荷相互作用,吸附并聚集红细胞从而促进局部血凝块形成。然而,单纯壳聚糖材料形成的红细胞聚集体不稳定,止血强度不足,对于高压力性动脉出血易发生二次出血;氧化石墨烯是近年来备受关注的一种新型无机止血材料,其主要止血机制是可显著聚集并激活血小板从而促进凝血,具有快速、稳定的优势。然而单纯氧化石墨烯材料细胞毒性较大、生物相容性低,限制了其在止血领域的进一步应用。因此,分别利用壳聚糖和氧化石墨烯化学结构的易修饰性,将这两种具有不同止血特性的材料进行复合,得到止血性能和安全性更优的复合止血材料,为新型局部止血敷料研发提供新思路。肢体结合部位是指腹股沟、腋窝等躯干和四肢连接的特殊解剖部位。现代战争中,由于单兵躯干、头部及四肢等部位个人防护装备研究的迅速发展,这些不易防护的肢体结合部位损伤出血伤情的发生率相对显著增加。据统计,近年来肢体结合部位损伤出血发生率已达以往战争的5倍。因此,针对肢体结合部位深部组织大出血的战现场救治研究重要性也日益凸显。腹股沟、腋窝等肢体结合部位由于解剖特殊无法采用常规止血带等装置按压止血,同时局部有股动脉、锁骨下动脉等多条大动脉分布,一旦发生出血往往出血程度严重,对止血材料活性要求非常高。尤其是战时枪弹伤伤情,往往还具有体表创口非常狭小、体内出血部位深、止血材料难以被导入深部出血位点的难点,因此,积极研发具有良好导入功能同时止血活性优异的便携式肢体结合部位止血装置,是我军战伤救治止血领域亟待解决的重点研究内容。综上,本论文首先采用壳聚糖和氧化石墨烯交联的方式制备得到一种既具有强效止血活性同时安全性良好的新型复合止血敷料;并在试验室前期研究基础上研发了一种可适用于腹股沟、腋窝等肢体结合部位深部组织大出血的新型推注式止血装置,采用标准化小型猪肢体结合部位大出血模型对括壳聚糖-氧化石墨烯复合止血材料及推注式止血装置统一进行止血评价研究。为我军战创伤大出血救治提供了新型止血材料及装置候选品种及标准化大出血动物模型评估技术。一、壳聚糖交联氧化石墨烯复合止血材料研究本章采用戊二醛为交联剂,优化合成了一种壳聚糖与氧化石墨烯交联制备新型壳聚糖-氧化石墨烯复合止血材料(CSGO)的制备工艺,完成了壳聚糖交联氧化石墨烯复合止血海绵的结构和理化性质表征的研究、并对其止血机理、止血活性及安全性进行了系统评价研究。结果显示,壳聚糖及氧化石墨烯水溶液按质量浓度比5:2交联时,所得材料体外凝血时间最短,止血活性最强;傅里叶变换红外光谱及X-射线衍射结果显示壳聚糖和氧化石墨烯成功交联生成复合止血材料;扫描电镜结果显示壳聚糖交联氧化石墨烯复合止血海绵具有明显的多孔三维结构,孔隙率为75.0%,吸液性能测试结果提示壳聚糖交联氧化石墨烯复合止血海绵具有强吸水性能,最大吸生理盐水倍率约为60.0倍。体外凝血机制研究显示,壳聚糖交联氧化石墨烯复合止血海绵与新鲜抗凝全血反应后,可以显著降低体外凝血时间并增强血凝块强度。冷冻电镜显示壳聚糖交联氧化石墨烯复合止血海绵表面可黏附红细胞、血小板等细胞成分,从而促进局部凝血发生。此外,APTT、PT结果表明壳聚糖交联氧化石墨烯复合止血海绵可以同时激活内、外源凝血通路而促进凝血。在大鼠断尾试验和大鼠股动静脉完全切断止血试验中显示出壳聚糖氧化石墨烯复合止血海绵对小血管及微小血管出血具有良好的止血性能;在小型猪股动静脉完全切断大出血模型试验中,壳聚糖氧化石墨烯复合止血海绵的按压止血时间显著少于对照材料Celox Gauze,提示壳聚糖氧化石墨烯复合止血海绵具有强止血活性,对大动脉损伤导致的高压力性大出血急救同样有效,且止血后局部血管及组织病理组织HE染色未见明显炎症或病理反应。体外细胞毒性试验、急性毒性试验及溶血试验均未见异常,提示生物安全性良好。二、对新型推注式压缩纤维素止血装置进行了安全性、有效性及稳定性研究课题组自主研发了一种具有深部导入功能的新型推注式压缩纤维素止血装置,该装置主要由外部的导入部件和内部荷载的压缩纤维素止血颗粒组成。外部导入部件主要起存储和导入的作用,内部荷载的压缩纤维素止血颗粒可通过迅速吸收血液中水分、体积膨胀从而有效填充伤腔、对局部损伤血管形成有效压迫而发挥快速强效止血活性。吸液膨胀性能测试结果显示,压缩纤维素止血颗粒在生理盐水体系中可迅速吸液并发生体积膨胀,吸液速率可在3 s即达6.2±0.1倍,最大吸液倍率7.3±0.2倍,最大体积膨胀率为9.0±0.3倍;在体外凝血时间以及血栓弹力图仪分析中可得出,压type 2 immune diseases缩纤维素止血颗粒可显著缩短凝血时间;小Etoposide化学结构型猪腹股沟区深部大出血模型止血试验结果显示,与国外产品CELOX-A~(?)相比,压缩纤维素止血颗粒可以明显缩短按压止血时间及所用产品数量(p<0.05),提示在止血活性和勤务适用性上更优于国外对照材料,且止血前后受试动物的血常规、PT、APTT及损伤部位病理组织测试结果均未见异常,体外细胞毒性试验、溶血时间、急性毒性等生物安全性结果良好。综上,推注式压缩纤维素止血装置有望为特殊肢体结合部位深部组织大出血伤情提供关键救治技术,为我军战伤救治提供一种新型救治药械品种支撑。

鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)感染是由鸡滑液囊支原体引起的鸡的呼吸道传染病。有的分泌蛋白属于两型蛋白,除了具有分泌蛋白的功能以外还展现膜蛋白的特性,脂相关膜蛋白(Lipid-associated membrane proteins,LAMPs)以及分泌蛋白在支原体对宿主的致病过程中发挥着关键作用。实验室前期研究发现,LP53蛋白是MS的一种分泌蛋白,推测其与MS的毒力以及致病性相关。本研究通过对MS分泌蛋白LP53的生物学功能研究,旨在探索该蛋白在鸡滑液囊支原体致病性过程中的作用,同时也为支原体以及支原体中分泌蛋白致病机制的研究奠定分子基础。首先,通过Overlap PCR扩增,获得突变后的MSlp53基因全长序列,并用该序列构建了两种不同的原核表达系统,即pColdI-MSlp53-BL21和pGEX-4T-MSlp53-BL21;通过LY294002研究购买表达纯化获得带不同标签的MSLP53蛋白,即His-MSLP53和GST-MSLP53。用纯化后的His-MSLP53蛋白免疫实验兔、鼠,制备抗His-MSLP53兔、鼠阳性血清。Western blot试验发现His-MSLP53蛋白能与MS阳性鸡血清发生特异性反应条带,证实其具有较好的免疫原性,其抗血清能介导体外的补体杀菌,杀菌率可达86.4%。WeAnti-hepatocarcinoma effectstern blot及悬浮免疫荧光试验结果证明MSLP53主要存在于MS WVU1853的膜表面及MS菌体培养上清中,可能是一种分泌蛋白。间接免疫荧光试验结果表明His-MSLP53蛋白具有较强的细胞黏附能力,且抗His-MSLP53血清不仅能显著抑制该蛋白对DF1细胞的黏附,还能抑制MS菌对DF1细胞的黏附,黏附抑制率为61.8%,可见MSLP53蛋白在MS黏附宿主细胞过程中发挥着重要作用。此外,Western blot及ELISA结果证明His-MSLP53蛋白能与细胞外基质蛋白cPlg结合,推测该结合作用是其黏附宿主细胞的机制之一。然后,采用MTT法测定GST-MSLP53蛋白对宿主细胞的细胞毒性作用,并以GST蛋白作为对照。结果显示,与GST蛋白相比,GST-MSLP53蛋白能使得HD-11细胞活性显著下降,且随着蛋白浓度(40、60、80、100、120μg/mL)的增加,GST-MSLP53蛋白对HD-11的细胞毒性作用显著增加。接着,对MSLP53对HD-11细胞的促炎性反应进行了检测。通过qPCR以及ELISA检测GST-MSLP53蛋白对HD-11细胞IL-1β转录水平以及翻译水平表达情况的影响,结果显示,以GST蛋白处理的HD-11细胞作为对照,GST-MSLP53蛋白处理后HD-11细胞中促炎性细胞因子IL-1β在转录水平以及翻译水平均显著性上调表达。此外,NF-κB是细胞炎性和凋亡反应中常见的信号通路,其下游信号分子p65入核试验证实GST-MSLP53蛋白的刺激可以诱导HD-11细胞发生显著的p65入核现象,从而初步证明鸡滑液囊支原体通过分泌MSLP53经NF-κB信号通路上调促炎性细胞因子的表达。通过显微镜下观察GST-MSLP53蛋白刺激对HD-11细胞状态的影响,结果发现,与GST处理组相比,GST-MSLP53蛋白处理24 h后HD-11细胞皱缩、变圆、甚至皱裂、死亡,且随着处理浓度(50、100、150 μg/mL)的增加,细胞的损伤增加;接着,对MSLP53蛋白对HD-11细胞的致凋亡作用进行了检测。通过Western blot检测到了 GST-MSLP53蛋白处理后Caspase 3的剪切,且随着处理浓度(50、100、150 μg/mL)的增加,cleaved-Caspase 3表达量增加,表明GST-MSLP53蛋白能诱导HD-11细胞产生凋亡。Annexin V-FITC/PI染色法检测p3×Flag-CMV-14-MSlp53转染HD-11细胞后的凋亡情况,结果显示转染24 h后细胞产生凋亡,进一步证明MSLP53蛋白对细胞的致凋亡作用。综上所述,MSLP53蛋白是MS WVU1853的一种分泌蛋白兼膜蛋白,具有较好的免疫原性,其抗血清能介导体外补体杀菌。该蛋白具有较强细胞黏附能力,其抗血清能显著抑制其对DF1细胞的黏附作用,且MSLP53能与cPlg发生结合,可Smoothened Agonist能是其参与黏附的作用机制之一。此外,MSLP53对HD-11细胞具有细胞毒性作用,能引起HD-11细胞形态发生显著性改变。其不仅能经NF-κB信号通路诱导HD-11细胞IL-1β转录和翻译水平的上调表达,还对HD-11细胞具有致凋亡反应,表明其参与MS与宿主细胞的黏附及致病过程,并发挥着重要的作用,值得对其进行更深层次的研究,同时为MS分泌蛋白的生物学功能研究提供了分子基础。

目的 建立m~6A特异性烯丙基标记测序（m~6A-selective allyl chemical labelingantibiotic antifungal and sequencing,m~6A-SAC-seq）实验方法体系，在单核苷酸分辨率水平对RNA的N~6-甲基腺苷（m~6A）修饰进行检测。方法 m~6A烯丙基标记测序（m~6A-SAC-seq）使用特异性甲基转移酶MjDim1对m~6A添加烯丙基标记成为N~6-烯丙基-甲基腺苷（am~6A），使用I_2处理产生N~1,N~6-环化腺苷（A）产物，在逆转录时引入突变，从而实现在单核苷酸分辨率水平的检测。通过HPLC法纯化甲基转移酶MjDim1，使用探针及液相色谱-质谱联用系统SB203580 molecular weight（LC-MS/MS）检测m~6A的转换率，计算MjDim1活性作为质控。提取样品RNA，用烯丙基标记m~6A，并用m~6A-SAC-seq技术构建文库，测序后通过数据分析得到m~6A位点信息，通过标准曲线校准计算得到m~6A的含量。结果 m~6A-SAC-seq处理后，HIV逆转录酶识别环化的am~6A位点，引入突变，但附近未修饰位点不发生突变。通过特定的A突变成T/C的突变位置（A to T/C）来识别m~6A位点，并添加内参探针，用标准曲线来定量m~6A含量。结论 m~6A-SAC-seq技术仅需30 ng的mRNA或去除了rRNA的总RNA样本就可以实现m~6A位点在单核苷酸分辨率PR-171水平的检测。