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癌症是威胁人类健康的主要疾病之一,具有早期不易发现和中晚期难以治疗的特点,发病后往往给患者的身心造成巨大伤害。尽管近年来在外科手术治疗、放射线治疗、靶向药物治疗和免疫治疗等方面取得了一些进展,但其治疗效果仍远不能满足患者的需求。因此,不断探索和创新癌症的治疗方法仍具有重大的现实意义和社会价值。癌症的本质原因是原癌细胞基因的突变,从基因角度研究癌症的治疗方法具有重要意义。作为一种强有力的基因编辑工具,CRISPR基因编辑系统已广泛应用于促癌/抑癌基因、癌症模型构建和癌症诊断等领域的研究。然而,当前利用CRISPR直接对癌细胞进行杀伤的研究还相对较少。即使当前有限的研究,也主要集中在利用CRISPR破坏癌细胞表达功能性蛋白的外显子上。这种杀伤策略的有效性会受到CRISPR编辑效率和癌症异质性的限制。CRISPR在直接杀伤癌细胞方面的研究相对较少,是因为面临着以下难点:如何特异性地编辑癌细胞而不影响正常细胞;如何将CRISPR系统高效地、特异性地递送到癌细胞内;如何在保证编辑特异性和递送特异性的前提下,提高CRISPR系统在癌细胞内的编辑效率。本文聚焦于利用CRISPR直接杀伤肿瘤细胞这一主题,致力于解决上述难题,以期为肿瘤治疗提供新的思路和方法。本研究以人类基因组中非编码区最大的重复序列——Alu序列Medical toxicology为编辑目标,利用CRISPR剪切癌细胞基因组中广泛分布的Alu重复序列。通过这种方法,使癌细胞染色体产生海量断裂,整体破坏癌细胞基因组DNA,最终杀死癌细胞。这项研究为探索新的癌症治疗方法提供了一条新的思路。本文主要在以下四个方面开展了研究:1.Alu一致序列的筛选与确定Alu序列是人类基因组中一种重要的重复序列,伴随人类的漫长演化历程,可以细分为多个亚家族。这些亚家族的一致序列存在一定的差异,因此需要从中选择一个合适的Alu一致序列作为CRISPR系统的攻击靶标。为了寻找合适的Alu一致序列,本研究使用了BLAST方法在不同家族的Alu一致序列在人类基因组GRCh38.p14中的分布进行了检索。实验结果表明,由位置频率矩阵统计得到的Alu一致序列大量且广泛地分布于人类细胞每一根染色体上,相对于其他家族的Alu一致序列,更适合作为破坏基因组DNA的CRISPR剪切靶标。2.胞外剪切Alu一致序列对基因组DNA的损伤为了探究CRISPR系统对Alu一致序列的剪切是否会破坏基因组DNA,我们进行了细胞外切割实验。实验中使用了Cas12a核酸内切酶和靶向Alu序列的cr RNA,分别对Alu一致序列的DNA片段、Alu一致序列的PCR扩增产物、HEK-293T细胞基因组DNA、五种癌细胞基因组DNA和五种不同生物的基因组DNA进行切割。同时,我们还对比了切割Alu一致序列和切割单拷贝基因对基因组DNA的破坏程度。实验结果表明,CRISCobimetinib体内PR可以切断Alu一致序列的DNA片段,并且可以切断癌细胞扩增所得的Alu序列。此外,我们发现CRISPR对Alu一致序列的剪切会导致人类基因组DNA的完全降解,并且可以完全消化五种癌细胞的基因组DNA。然而,这种剪切造成的破坏仅限于含有Alu序列的人类基因组DNA。相比之下,剪切单拷贝基因对基因组DNA的破坏并不明显。实验结果证明了CRISPR系统对Alu一致序列的剪切可以破坏基因组DNA,并且这种破坏主要局限于含有Alu序列的人类基因组DNA。3.胞内切割Alu一致序列对癌细胞毒性的考察为了研究在细胞内剪切Alu一致序列对基因组DNA的破坏以及剪切所产生的细胞毒性,我们将剪切Alu序列的CRISPR系统克隆至质粒并整合绿色荧光蛋白报告系统,然后使用Lipofectamine 3000将质粒转染至HEK-293T等细胞。对转染后的细胞进行荧光镜检、流式细胞术统计和细胞毒性分析,以考察被剪切Alu序列后的细胞的生理状况。此外,我们还使用免疫荧光表征了剪切Alu序列后产生的大量DNA双链断裂现象。为了提高CRISPR系统的递送水平,我们将切割Alu一致序列的CRISPR系统包装至Ad5重组腺病毒。实验结果显示,传统的编辑单拷贝基因杀伤癌细胞的方法会使少量细胞逃脱基因编辑带来的不利影响,进而存活下来并再次增殖,而Cselleck MDV3100RISPR对Alu重复序列的剪切使细胞难以存活和继续增殖。此外,我们发现剪切Alu一致序列的不同位点和使用不同的Cas酶会造成不同的细胞毒性。免疫荧光分析显示,剪切Alu一致序列使癌细胞产生大量的DNA双链断裂。以腺病毒为载体递送CRISPR系统至癌细胞提高了转导效率。此外,我们将表达Cas12a蛋白的元件和cr RNA的元件包装至不同的重组Ad5腺病毒进行转导,既降低了生物安全风险,又保证了较高的共感染效率及细胞毒性。这些实验结果证明了在细胞内剪切Alu一致序列可以破坏基因组DNA并产生显著的细胞毒性。4.特异性剪切癌细胞Alu一致序列的CRISPR系统的设计和优化为了特异性地靶向癌细胞进行Alu序列的剪切,本文提出了一种基于甲胎蛋白(Alpha-Fetoprotein,AFP)启动子和位点特异性重组酶的CRISPR编辑系统,并对其进行了设计和优化。甲胎蛋白启动子是一种肿瘤特异性启动子,本文以甲胎蛋白阳性的肝癌细胞系为研究对象,比较了不同结构的甲胎蛋白启动子驱动CRISPR-Cas12a表达的效率,并选择了最优的甲胎蛋白启动子p AFP(a2b)进行后续实验。通过结合位点特异性重组酶和串联终止子元件,本文构建了多种肝癌细胞内特异性表达CRISPR系统的模型,并对其特异性和杀伤效率进行了评估。实验结果表明,本文成功构建了一种兼具表达特异性和高表达效率的双重组腺病毒系统,实现了对多种AFP阳性肝癌细胞的靶向杀伤。基于m CMV启动子、甲胎蛋白启动子、位点特异性重组酶和串联终止子元件构建的双重组腺病毒系统,在表达特异性上,与使用纯甲胎蛋白启动子的系统持平;在表达效率上,达到了纯m CMV启动子系统的74.5%。此项研究打破了以往CRISPR系统仅限于编辑外显子基因位点以消灭癌细胞的框架。实验结果显示,剪切Alu重复序列相较于剪切单拷贝基因,能更有效地提高CRISPR杀死癌细胞的功效。在递送方式上,本研究运用了双重组腺病毒系统,既确保了安全性,又显著提升了传递效率,超越了脂质体转染法。特别值得一提的是,本项研究提出了肿瘤特异性启动子与位点特异性重组酶配合使用的创新构架,从而在表达效率和表达的特异性上都取得了显著的提升。总之,这项研究提供了一种全新的从基因层面治疗癌症的创新策略,通过高效破坏癌细胞基因组,为癌症的治疗前景带来了新的希望。

通过点击化学（CuAAC反应）设计、合成了22个香豆素衍Baf-A1体内实验剂量生物。多数化合物在微摩尔范围内表现出良好的AChE和MAO-B双抑制活性，具有良好的生物相容性。尤其是一种名为A2Hgenetic exchange5的化合物，对AChE（IC_(50)=0.23±0.02μmol/L）和MAO-B（IC_(50)=0.31± 0.03μmol/L），是最佳的AChE/MAO-B双抑制剂。实验结果表明香豆素基团是一类有效的Talazoparib化学结构AChE和MAO-B双抑制活性基团，羟基取代苯环的存在能够增强抑制活性。分子对接研究发现A2H5是双位点抑制剂，苯基部分结合到AChE的CAS位点，香豆素结合到PAS位点，三氮唑环占据两个活性位点的中间峡谷。A2H5的香豆素部分结合到MAO-B的入口空腔，苯基部分结合到底物空腔，并嵌入到Tyr435、Tyr398 和FAD形成的“芳香笼”。总之，香豆素C7位置取代衍生物可以被开发为AChE/MAO-B双抑制剂，为进一步开发抗AD的双靶点药物提供一个新的起点。

叉虫责科(Nemouridae)隶属于襀翅目(Plecoptera)北襀亚目(Arctoperlaria),是襀翅目中最大的科之一。目前叉虫责科的分类地位一直存在争议,属间亲缘关系不清晰。当前主要是传统的形态学分类和少量基因片段的分子系统学的研究,而利用线粒体全基因组分析的研究相对来说较少。线粒体基因组的排列方式与其系统进化和基因功能息息相关。通过分析线粒体基因组的碱基组成、基因顺序和基因组结构的变化来研究线粒体基因组的多样性;利用线粒体基因组序列,通过系统发育重建,可以揭示物种间的进化关系、种群遗传演化,以及功能基因演化的历程。在襀翅目中,利用线粒体基因组的系统进化分析,成功地解决了一些selleck NMR有争议的属和种的分类问题。本研究对叉虫责科8属15种昆虫样本进行高通量测序,获取线粒体基因组序列,通过对其拼接和注释,分析比较其线粒体基因组基本结构、核苷酸组成、密码子使用、蛋白质编码基因、t RNA、r RNA和控制区结构。研究还结合Gen Bank已发表的真颚组28种昆虫线粒体基因组数据和2种外群(始虫责科)线粒体基因组数据,使用13个PCG和2个r RNA数据集进行叉虫责科和真颚组系统发育分析。结果显示叉虫责科昆虫线粒体基因组高度保守没有发现needle prostatic biopsy重排现象;t RNA和r RNA的结构也相对保守;叉虫责科蛋白质编码基因起始密码子使用最多的是ATT密码子,其次是ATG密码子,终止密码子偏好使用TAA密码子;基于PCG和PCG12数据集的ML和BI分析结果表明,叉虫责科内两个亚科的单系性仍无法较好地重建,但都支持Soyedina和Zapada的姊妹群关系,以及球尾叉虫责属和中叉虫责属的姊妹群关系,R428抑制剂不支持Malenka和倍叉虫责属的姊妹群关系。此外,所有的拓扑结构均重建了真颚组昆虫的系统发育关系为:((((叉虫责科+背虫责科)+卷虫责科)+(黑虫责科+带虫责科)+裸虫责科);均支持叉虫责科和背虫责科的姊妹群关系,以及黑虫责科和带虫责科的姊妹群关系。

外泌体是几乎所有细胞都会分泌、直径约为30～150 nm,具有脂质双分子层结寻找更多构的盘状囊泡,广泛分布于各种体液中,作为细胞间物质运输和信息通讯的重要媒介,直接影响了细胞的各种生理状态,并参与了多种疾病的发生发展。作为一种非侵入、具有细胞特异性的治疗性纳米载体,外泌体能有效地将货物输送到靶细胞,减少对正常细胞的伤害,增强治疗效果。本论文利用基因工程技术和外源性外泌体分离后修饰技术对天然外泌体进行定制化改造,制备具有特定生物功能的外泌体,并应用于重编程肿瘤细胞与免疫细胞的靶向识别,增强免疫细胞识别肿瘤细胞的能力。针对免疫原性低和癌细胞脱靶等问题,通过内源性改造获得膜表面表达水泡性口炎病毒糖蛋白(VSVG)的融合外泌体,利用膜表面修饰技术得到重编程修饰肿瘤细胞的功能化外泌体,并对其生物功能进行验证,探究了其增强免疫识别方面的应用潜力。主要研究内容如下:1.融合外泌体的构建及膜融合效应。外泌体自身生物特性受其亲本细胞的影响,并对其靶细胞具有特定的特征和作用。在本项工作中,通过基因工程修饰技术对亲本细胞进行改造,使其表达具有特定生物功能的病毒性融合蛋白,并分泌获得膜表面负载VSVG的融合性外泌体(VSVG-Exos)。以小鼠乳腺癌细胞为研究对象,通过一系列实验探究了 VSVG-Exos与小鼠乳腺癌细胞的膜融合效应,证明VSVG蛋白能在酸性条件下调控VSVG-Exos与小鼠乳腺癌细胞的相互作用,促进VSVG-Exos与肿瘤细胞膜融合。2.功能化外泌体重编程肿瘤细胞与免疫细胞之间靶Medical diagnoses向识别。肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用是癌症免疫治疗成功的关键,增强肿瘤细胞与免疫细胞的相互识别对有效清除肿瘤细胞,Liraglutide作用抑制癌症发展具有重要作用。本项工作以小鼠乳腺癌细胞和小鼠树突状细胞为研究对象。利用细胞瞬时转染手段和膜表面修饰技术对天然外泌体进行定制改造,获得膜表面展示VSVG和DC-SIGN核酸适配体的功能化外泌体。外泌体膜表面表达的VSVG蛋白能在酸性条件下促使功能化外泌体与肿瘤细胞膜融合,并将膜表面信息转移至肿瘤细胞表面。与此同时,在DC-SIGN核酸适配体的作用力下,促进免疫细胞与肿瘤细胞相互识别,从而实现增强细胞间精准识别和特异性靶向作用。

目的目前肥胖是全球最严重的健康问题之一。食物摄入过多是导致肥胖的主要原因。因此深入研究摄食的调节机制,有助于寻找靶点,治疗肥胖。摄食功能主要受中枢神经系统和肠道内分泌系统的调控。已有研究显示,钙离子敏感受体(CaSR)在中枢和摄食调控有关的脑区广泛分布,包括下丘脑,脑干和边缘系统,尤其在脑干极后区(AP)中有丰富的表达。AP与孤束核(NTS)之间有紧insect microbiota密的纤维联系,而NTS中的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)阳性神经元与臂旁核(PBN)有单突触联系,因此本研究主要探究AP中CaSR通过NTS-PBN GLP-1通路影响摄食的机制。方法1.摄食行为分析法,观察AP微量给予CaSR激动剂-R568后对正常和肥胖小鼠摄食量的影响;GABA-A受体阻断剂、GLP-1R阻断剂Canagliflozin化学结构对R568引起的摄食抑制作用的影响;2.酶联免疫吸附法(ELISA),检测正常及肥胖小鼠AP中神经递质γ-氨基丁酸(GABA)、CaSR、NTS中GLP-1及PBN中GLP-1R的含量;3.AP中微量注射顺行示踪病毒(rAAV-hSyn-mCherry-WPRE-hGH pA),观察AP-NTS的神经纤维投射及其与GLP-1阳性神经元解剖关系;4.利用Gcg-IRES-CreERT2小鼠,采用化学遗传法(NTS注射AAV-EFla-DIOh M4D(Gi)-EGFP-WPRE)抑制NTS中GLP-1神经元,观察对R568引起的摄食抑制作用的影响;5.采用免疫荧光染色法,观察NTS中GLP-1和c-fos免疫阳性细胞及PBN中胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)与c-fos的共染情况;6.制作高脂饮食诱导肥胖小鼠模型,AP连续微量注射R568两周后,观察小鼠体重变化。结果1.摄食结果显示,AP中微量注射R568后,与DMSO组相比,在0-1h,1-2h内,小鼠的摄食量明显减少(P<0.05)。2.ELISA法结果显示,AP微量注射R568后,与对照组相比,AP中GABA的含量明显增加(P<0.05),同时,NTS中GLP-1的释放也显著增加(P<0.05)。3.免疫荧光染色结果显示,AP中微量注射R568后,与对照组相比,NTS中GLP-1,c-fos免疫反应阳性神经元及GLP-1与c-fos免疫反应阳性共表达神经元数目明显增加(P<0.05)。4.预先在AP中微量注射GABA-A受体阻断剂BicuElexacaftorculline,R568引起的厌食效应减弱(P<0.05)。5.顺行追踪技术联合免疫荧光染色结果显示,AP中微量注射顺行病毒后,在荧光显微镜下观察到NTS中有明显顺行纤维,IF结果显示GLP-1阳性神经元周围有顺行纤维。说明AP有神经元发出投射到NTS GLP-1阳性神经元。6.Elisa结果显示,AP中微量注射GABA-A受体阻断剂Bicuculline后,减弱了R568引起GLP-1含量增加(P<0.05)。7.化学遗传法结果显示,抑制NTS的GLP-1神经元后,R568引起的厌食效应减弱(P<0.05)。8.荧光免疫组织染色方法研究显示,AP中微量注射R568后,与对照组相比,PBN中GLP-1R、c-fos免疫阳性及GLP-1R与c-fos免疫阳性共表达神经元的数量显著增加(P<0.05)。9.预先在PBN中微量注射GLP-1R阻断剂Exendin(9-39),R568引起的厌食效应被抑制(P<0.05)。10.摄食结果显示,在肥胖小鼠的AP中微量注射R568后,与对照组相比,在0-1h,1-2h内,肥胖小鼠的食物摄入量明显减少(P<0.05)。11.Elisa结果显示,肥胖小鼠中CaSR的含量明显增加,NTS中GLP-1及PBN中GLP-1R水平显著降低(P<0.05);IF结果也显示肥胖小鼠中CaSR阳性神经元的数目明显增加,而NTS中GLP-1以及PBN中GLP-1R阳性神经元的数目明显降低。12.肥胖小鼠AP连续14天微量注射R568之后,与DMSO组相比,小鼠体重明显降低;NTS中GLP-1的含量及PBN中GLP-1R的含量也明显增加(P<0.05)。荧光免疫组化观察到NTS GLP-1阳性神经元和PBN GLP-1R表达量增加。结论在正常小鼠,AP的CaSR激活可以通过促进GABA的释放,进而引起小鼠短时间内食物摄入量降低。该作用与AP-NTS-PBN的GLP-1通路激活有关,但AP的GABA神经元不参与该作用。肥胖小鼠NTS-PBN的GLP-1通路活性降低可能和肥胖的发生有关;肥胖小鼠AP中CaSR表达量明显增加,AP微量注射R568 2周,可通过激活CaSR,提高AP-NTS-PBN的GLP-1通路兴奋性,进而抑制摄食,降低小鼠体重。我们的研究将为肥胖的治疗提供新的靶点,为能量代谢疾病的研究提供新的方向。

【目的】确定蛹虫草甲羟戊酸途径中的2个关键酶——磷酸甲羟戊酸激酶(CmErg8)和焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶(CmErg19)的功能及其对麦角甾醇和虫草素含量的影响。【方法】通过生物selleck抑制剂信息学分析鉴定蛹虫草中CmErg8和CmErg19，并采用酵Hepatoma carcinoma cell母互补确定其功能是否保守；以蛹虫草尿嘧啶营养缺陷型CmΔpyrG为背景菌株，利用农杆菌介导的转化方法对CmErg8和CmErg19进行过表达，观Etoposide察其对麦角甾醇和虫草素含量的影响。【结果】CmErg8和CmErg19不能互补酵母erg8和erg19突变体的温度敏感表型；CmErg8和CmErg19过表达菌株中麦角甾醇和虫草素含量均有所增加，特别是CmErg19基因过表达可以使虫草素含量提升5倍左右。【结论】本研究揭示了蛹虫草CmErg8和CmErg19的功能，并且发现蛹虫草麦角甾醇合成通路基因可能会影响虫草素含量。

前列腺癌(Prostate cancer,PCa)是一种雄激素驱动的疾病,使用新型雄激素受体(androgen receptor,AR)抑制剂联合雄激素剥夺治疗可以获得明显的生存优势。尽管前列腺癌发展早期这种治疗手段能明显缓解病情,但几乎所有患者最终都会出现去势抵抗,对激素疗法产生耐药。多种基因组靶向药物、抗体偶联物和免疫疗法有望在未来改善前列腺癌患者的治疗现状。基因突变和免疫抑制是去势抵抗性前列腺癌(Castration-Resistant Prostate Cancer,CRPC)进展的重要原因。研究表明,约50%CRPC患者的磷酸酯酶与张力蛋白同源物(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)低表达。PTEN缺失可调控AR转录因子、激活PI3K/AKT通路,促进肿瘤生长。此外,炎症因子白介素23(interleukin-23,IL-23)是CRPC发展过程中的重要驱动因子。IL-23能够促进雄激素受体的转录和信号传导,并在维持前列腺癌细胞增殖方面起重要作用,间接促进去势抵抗性前列腺癌的发展。基于以上问题,Rapamycin采购本研究拟从基因治疗和免疫治疗两个方面考虑,制备递送效率良好的脂质纳米粒(Lipid nanoparticles,LNP)用于PTEN质粒的递送,以恢复PTEN的抑癌功能,同时使用IL-23抑制剂Apilimod阻断IL-23在CRPC进展中的驱动作用,二者协同发挥抗肿瘤作用,抑制CRPC的进展和转移。本研究构建了载PTEN质粒的脂质纳米粒(简称LNP@PTEN)并将其与IL-23抑制剂Apilimod组成联合治疗体系,以期从基因治疗和免疫治疗两个方面入手,延缓CRPC的发展进程,提高抗肿瘤疗效。本课题主要分为三个章节,第一章是脂质纳米粒的构建及表征。本章节我们通过迈克尔加成反应合成了脂质纳米粒的重要组成部分——阳离子脂质246C10。我们使用246C10、DSPC、β-谷甾醇和PEG_(2K)-DMG,通过自组装形成空白脂质纳米粒(简称LNP-Blank)。LNP-Blank为正电性纳米粒,可以与带负电的PTEN质粒通过静电吸附作用形成复合物LNP@PTEN。随后我们对所制备的脂质纳米粒进行了表征。空载的LNP-Blank粒径为(129.55±2.35)nm,Zeta电位为(29.7±1.4)m V。加入质粒形成LNP@PTEN后粒径增加至(131.8±3.1)nm,Zeta电位为(-2.35±0.75)m V。使用透射电子显微镜(Trbiotic elicitationansmission Electron Microscope,TEM)观察脂质纳米粒形态,LNP-Blank和LNP@PTEN均为类球形,且载PTEN质粒前后纳米粒形态没有出现明显变化。纳米粒可在20天内保持稳定,并通过琼脂糖电泳证明了脂质纳米粒对PTEN质粒的包载能力。第二章是联合治疗体系的体外研究,在细胞水平研究脂质纳米粒和抑制剂联合治疗体系的体外特征。首先对脂质纳米载体的毒性进行了考察,使用200μg/m L的LNP-Blank处理后的细胞活力良好,且细胞毒性远低于Lipo8000。流式细胞检测仪检测RM-1细胞对脂质纳米粒的摄取情况,并采用激光共聚焦检测摄取后的荧光分布。脂质纳米粒被RM-1细胞成功摄取,EGFP质粒表达的绿色荧光蛋白在细胞质中被观察到。使用EGFP质粒代替PTEN质粒进行核酸转染实验,通过设置不同的LNP/EGFP质粒质量比,确定了当质量比为7时,脂质纳米粒的转染效果最好。LNP@EGFP在拥有比Lipo8000更好的转染效率的同时显示出较Lipo8000更低的细胞死亡率。最后,对联合药物治疗体系的体外抗侵袭转移能力进行了考察。Apilimod组和LNP@PTEN组均表现出一定的抗侵袭转移效果,且二者表现出协同作用,联合治疗组具有较单药组更强的抗侵袭转移能力。第三章是联合治疗体系的抗去势抵抗性前列腺癌体内研究,对治疗体系的体内安全性、抗肿瘤效果等方面进行了考察。构建了C57BL/6J小鼠CRPC骨转移动物模型。采用小动物活体成像技术记录24 h内的药物体内分布情况,检测到LNP@DIR在肿瘤部位出现明显的荧光聚集。对Apilimod+LNP@PTEN的体内抑瘤作用进行考察,通过肿瘤体积生长变化情况、小鼠生存期等评价了联合治疗体系的抗肿瘤作用,证实了联合治疗具有协同作用,能够明显缓解肿瘤进展,延长小鼠生存期。另外,从组织切片HE染色、血生化指标检测等方面证明了联合治疗体系有良好的生物安全性。对Apilimod+LNP@PTEN的免疫调节机制进行了考察,结果显示联合治疗提高了CD8~+/CD4~+T的比例、减少了抑制性免疫细胞MDSCs的比例。最后,通过微计算机断层扫描技术(Micro computed tomography,Nirogacestat临床试验Micro CT)分析证实了PTEN质粒和IL-23抑制剂Apilimod的联合治疗对骨代谢的保护作用。本研究构建了脂质纳米粒LNP@PTEN,并将其与IL-23抑制剂Apilimod联合用于CRPC治疗。该脂质纳米粒可以利用EPR效应聚集于肿瘤部位,将PTEN质粒运送至肿瘤部位并释放在肿瘤细胞内,恢复PTEN的抑瘤功能。LNP@PTEN与Apilimod的联合使用可以从基因治疗与免疫治疗两方面协同治疗CRPC,抑制其进展和转移。本研究验证了两种药物具有良好的协同治疗效果,与单一用药相比显示出更加明显的肿瘤抑制作用。因此,这项研究可以为CRPC的治疗提供新策略。

目的:本研究通过基因编辑技术构建B细胞缺失小鼠模型(hPD-1/hPD-L1,Igh-J KO mice),并通过体内及体外实验对构建的小鼠模型进行验证,以期建立不发生大分子生物药免疫原性的动物模型,为抗体类药物候选分子的筛选及临床前的药效评价研究等提供高效合理的动物模型。方法:1.采用基因编辑技术构建Bcancer – see oncology细胞selleckchem RSL3缺失小鼠模型。2.采用PCR法检测子代小鼠基因型,以确定子代小鼠是否为目标小鼠;采用流式细胞术分析小鼠脾、骨髓细胞中Ig M及Ig D蛋白表达情况,以确定构建的小鼠体内B细胞是否缺失。3.采用流式细胞术分析小鼠脾、外周血及淋巴结中白细胞亚群及T细胞亚群变化情况,以评估B细胞缺失对小鼠各淋巴细胞亚群分布的影响。4.通过流式细胞仪分析hPD-1/hPD-L1,Igh-J KO小鼠的脾脏和外周血中的颗粒酶B、γ干扰素和增殖指数Ki-67的水平,以评估hPD-1/hPD-L1,Igh-J KO小鼠是否影响小鼠体内的NK细胞及T细胞的增殖与激活。5.建立MC38结肠癌小鼠模型,采用腹腔注射的给药方式,分别给hPD-1/hPD-L1,Igh-J KO荷瘤小鼠以及B细胞功能正常的hPD-1/hPD-L1荷瘤小鼠腹腔注射M7824,观察两种小鼠肿瘤体积及体重的变化情况。6.采用Elisa法检测小鼠血清中M7824类似物和抗M7824类似物抗体水平,以评估B细胞缺失小鼠是否能避免M7824的免疫原性影响,同时显示出M7824的抗肿瘤效应。结果:1.PCR结果显示:与野生型C57BL/6小鼠相比,hPD-1/hPD-L1,Igh-J KO小鼠中仅能检测到人PD-1、人PD-L1以及Igh-J,鼠PD-1及鼠PD-L1检测不到。2.流式细胞术结果显示:(1)野生型C57BL/6小鼠可检测到小鼠Ig M和Ig D,但在hPD-1/hPD-L1,Igh-J KO小鼠中检测不到。(2)野生型C57BL/6小鼠仅可检测到鼠PD-1,hPD-1/hPD-L1,Igh-J KO小鼠中仅可检测到人PD-1。(3)野生型C57BL/6小鼠仅可检测到鼠PD-L1,hPD-1/hPD-L1,Igh-J KO小鼠中仅可检测到人PD-L1。3.流式细胞术结果显示:(1)脾脏白细胞亚群分析发现,hPD-1/hPD-L1,IghJ KO小鼠B细胞发育失败,导致该小鼠B细胞缺失,T细胞、粒性白细胞和单核细胞所占比例显著增加(P(27)0.001),其他细胞如树突状细胞、巨噬细胞等由于细胞含量较少,未检测到细胞比例变化情况。(2)脾脏T细胞亚群分析发现,hPD-1/hPD-L1,Igh-J KO小鼠的CD8+T细胞百分率、CD4+T细胞百分率、调节性T细胞百分率与C57BL/6小鼠相似,未有明显改变。(3)在淋巴结和血液中得到类似的结果。4.流式细胞术结果显示:(1)与未接受聚肌苷酸胞苷酸的小鼠相比,经聚肌苷酸胞苷酸刺激后的hPD-1/hPD-L1,Igh-J KO小鼠及hPD-1/hPD-L1小鼠中,其外周血及脾细胞中NK细胞分泌的颗粒酶B以及γ干扰素水平显著升高(P(27)0.01)。(2)与未接受抗CD3ε抗体刺激的小鼠相比,经抗CD3ε抗体刺激后的hPD-1/hPD-L1,Igh-J KO小鼠及hPD-1/hPD-L1小鼠中,其脾细胞中CD4+T细胞及CD8+T细胞分泌的颗粒酶B、γ干扰素及Ki-67水平显著升高(P<0.01)。5.体内药效实验结果显示:(1)相同给药条件下,与B细胞功能正常的hPD-1/hPD-L1荷瘤小鼠相比,M7824在hPD-1/hPD-L1,Igh-J KO荷瘤小鼠中显示出显著的抗肿瘤效果(TGI=69.2%),而M7824在hPD-1/hPD-L1荷瘤小鼠上未显示出抗肿瘤效果。(2)与对照组相比,hPD-1/hPD-L1,Igh-J KO荷瘤小鼠在给药前后体重变化与B细胞功能正常的hPD-1/hPD-L1荷瘤小鼠保持一致,无明显差异。6.体外检测结果显示:(1)在hPD-1/hPD-L1,Igh-J KO荷瘤小鼠中,能够检测到血清M7824类似物,且血药浓度随着给药次数增加而增加,同时小RP56976采购鼠血清中未检测到抗M7824类似物抗体。(2)hPD-1/hPD-L1荷瘤小鼠在给药第10天后,不能检测到血清M7824类似物,且所有小鼠血清在第6天均能够检测到抗M7824类似物抗体。结论:1.B细胞缺失小鼠(hPD-1/hPD-L1,Igh-J KO mice)可用作肿瘤免疫药物的有效筛选动物模型,其保留了用于免疫治疗评估的重要免疫细胞类型,同时不会对抗药物抗体产生过敏反应。2.B细胞缺失小鼠(hPD-1/hPD-L1,Igh-J KO mice)仅B细胞缺失,而小鼠体内的NK细胞及T细胞的增殖和激活未受到影响,因此该小鼠模型可用于NK细胞及T细胞相关的免疫疗法的研究。3.B细胞缺失小鼠(hPD-1/hPD-L1,Igh-J KO mice)模型可以有效降低甚至避免免疫原性的产生,可为抗体药物的筛选及药效评价等研究提供帮助。

目的：探究益补胃宝汤联合质子泵抑制剂(PPI)治疗幽门螺杆菌(Hp)阳性慢性胃溃疡(GU)的效果。方法：选取2017年1月—2022年12月本院收治的65例Hp阳性GU患者，采用随机数字表法将其分为两组，对照组(33例)采用PPI治疗，观察组(32例)采用PPI联合益补胃宝汤进行治疗。intestinal immune system连续治疗4周后，评估两组患者临床疗效及中医症状评分，检测患者治疗前后胃蛋白酶原(PG)水平，并比较两组治疗方法的安全性。结果：观察组治疗总有效率高于对照组(P<0.05);治疗后两组中医症状评分(主症、次症及总评分)均降低，且观察组均低于对照组(P<0.05);治疗后两组PGⅠ水平升高，PGⅡ水平降低，且观察组PGⅠ水平高于对照组，PGⅡ水平低于对照组(P<0.05);两组不良反应总发生selleck LY-188011率比较差异无统计学意义(P>0.购买Pevonedistat05)。结论：益补胃宝汤联合PPI能够提高Hp阳性GU患者的疗效，改善中医症状及PG水平，且用药安全性良好。

目的 探讨应用改良式密闭回血法对降低维持性血液透析患者动静脉内瘘血栓形成风险的作用。方法 选取2021年11selleck Pidnarulex月—2022年10月接受规律性血液透析患者50例为研究对象。2021年11月—2022年4月采用传统密闭式双向回血法为对照组，2022年5月—2022年10月采用改良式密闭回血法为改良组，比较2组患者下机后的血压、下机内瘘穿刺点按压时间、内瘘渗血率、血栓发生率、透析器内红细胞的残余量、回血总时间、回血生理盐水量。结果 改良组下机回血量、overwhelming post-splenectomy infection下机回血时间、下机后血压、下机内瘘穿刺点按压时间、内瘘渗血率、下机回血的生理盐水量、内瘘血栓发生率、血液透析管路残余红细胞数均少于或低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05更多)。结论 改良式密闭回血法可以缩短下机回血的时间，减少0.9%氯化钠溶液的需要量，降低了内瘘渗血率，缩短内瘘下机按压时间，减少下机后血液透析管路里红细胞的残余，等量生理盐水回血的同时充分降低了内瘘局部的血液黏滞度。