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多环大环内酰胺(polycyclic tetramate macrolactam,PoTeM)是一类具有特特拉姆酸结构单元及多环体系的大环内酰胺,其化学结构新颖、生物活性广泛,具有良好开发前景。PeToMs根据多环体系不同,分为5-5双环、5-5-6三环和5-6-5三环等结构亚型。生物合成研究发现,醇脱氢酶OX4负责5-5-6三环HSAF内侧六元环合成,醇脱氢酶CftD催化5-6-5三环ikarugamycin的内侧五元环合成。目前,PoTeMs相关醇脱氢酶尚无蛋白结构报道,OX4与CftD及其同源蛋白催化还原环化反应的分子机制和底物选择性机制尚未阐明。基于上述研究背景,本论文开展了以下三方面的工作:1.醇脱氢酶OX4三元复合物及CftD的晶体结构研究。通过蛋白的表达纯化、蛋白晶体筛选优化、以及晶体衍射数据收集处理,成功获得并解析三元复合物OX4-NADP+-3-deOH ATC(2.3 A)、OX4-NADP+-3-deOHATB(2.8 A)、OX4-NADP+-3-deOH HSAF(2.6A)、OX4-NADP+-Y1(3.2A)和 apo CftD(2.0 A)的晶体结构。结构分析发现,OX4和CftD属于非锌依赖的醇脱氢酶,每条链含有一个催化结构域和一个核苷酸结合结构域,二者被一个疏水的裂隙分开。OX4三元复合物中底物和NADPH以T字形结合在上述裂隙区域。2.醇脱氢酶OX4的催化机理。1)通过分析OX4中可能定位NADPH的氨基酸残基和NADPH相关突变体体外功能,推测OX4中的G169和K195决定其更倾向于利用NADPH。2)通过分析OX4三元复合物结构,确定NADPH供氢的烟酰胺环C4接近底物受氢的C21位,为OX4的底物区域选择性提供了结构支撑。3)通过对比分析三元复合物结构和底物相关突变体体外功能immune-based therapy,发现OX4反应中的氢化物转移和质子传递均无氨基酸残基介导,因此质子可能直接来自溶剂水;底物结合口袋的氨基酸残基除W260外,可能仅通过影响底物与蛋白的结合而影响酶活。4)由于OX4W260F和CftDW261A均仅催化双键还原反应,结合可能的反应中间体结构,推测该保守色氨酸可能通过与底物C-1位羰基形成氢键,稳定反应过程中的烯醇式过渡态。5)通过比对3-deOH ATC和3-deOHATB的三元复合物结构,发现底物立体构型不同导致其在复合物中的摆放方式不同,可能造成了 OX4的底物立体选择性。3.醇脱氢酶OX4与CftD的底物环系选择性机制。通过蛋白结构和序列对比,定位了三个可能影响醇脱氢酶OX4与CftD底物环系选择性的氨基酸loop区域,并构建了相应loop区域互换的OX4和CftD突变体。体外酶活显示,CftDLEE011突变体C-3的底物环系选择性转变为与OX4一致。由此,推测决定OX4与CftD底物环系选择性的氨基酸loop区域为 loop291-300MK-1775试剂(CftD 中为 loop292-301)。综上所述,本论文基于PoTeMs生物合成研究基础,通过开展醇脱氢酶OX4三元复合物和apo CftD的结构生物学研究和突变体体外功能评价,初步解析了 PoTeMs相关醇脱氢酶OX4和CftD独特的还原环化反应机理和底物选择性机制。本研究,不仅为同类蛋白结构的获取提供了经验,拓宽了对醇脱氢酶催化机制的理解,而且为后续PoTeMs多环体系改造提供了结构基础和理论依据。

目的:世界范围内,癌症仍然是公共卫生问题。开展免疫细胞研究是当下最主要对抗癌症的方法之一,为有效控制前列腺癌对人体生命健康的影响,进行有关NK(natural killer cells,自然杀伤细胞)对于恶性肿瘤治疗的研究具有重大现实意义。自然杀伤(NK)细胞因其自主杀死靶细胞的能力而得名,是先天免疫中癌症的主要效应细胞。目前大多数利用肿瘤微环境的治疗方案都集中在T细胞免疫上,要么通过促进激活信号,要么抑制抑制信号。T细胞免疫疗法取得的有限成功凸显了开发新一代免疫疗法的重要性,例如利用以前被忽视的NK细胞。虽然肿瘤也进化为抵抗NK细胞诱导的细胞毒性,但细胞因子补充剂,抑制分子的阻断和NK细胞的基因工程可以克服这种耐药性,在实体和血液恶性肿瘤中都具有很大的前景。本研究中特别针对PSMA(Prostate specific membrane antigen,前列腺特异性膜抗原)开展关于CAR-NK(Chimeric antigen receptor NK cells,嵌合抗原受体NK细胞)抗击前列腺恶性肿瘤的研究。本次研究中,采用PEI慢病毒包装法将PSMA-CAR慢病毒载体包装成慢病毒,使其感染自然杀伤细胞(NK)后形成PSMA-CAR-NK细胞,进一步开展体外实验检测该细胞对前列腺癌细胞株的细胞毒性所起的作用。为获得更有针对性、更精准的杀瘤数据,在研究中首speech pathology先要建立NK细胞的体外培养方法,其次再根据CAR-T的思路,用慢病毒感染NK细胞制备CAR-NK,最后根据转基因细胞杀伤前列腺癌细胞株的最佳效应细胞和靶细胞的比Liproxstatin-1试剂例进行研究。方法:嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK)经嵌合抗原受体包装慢病毒感染NK细胞后,可使其更加精准表达嵌合抗原受体,进一步特异性靶向识别PSMA,成为转基因细胞杀伤前列腺癌细胞株。1、抽取健康人外周血后,分离出PBMC(Peripheral blood mononuclear cells,外周血单核细胞),利用细胞因子诱导和扩增NK细胞的方法,获取NK细胞,通过流式细胞仪测量NK细胞的比例。2、利用三载体系统转染293FT细胞包装制备慢病毒,然后通过PEG-8000的方法浓缩慢病毒。3、制备PSMA-CAR-NK细胞,通过对比慢病毒感染PBMC培养3天与PBMC培养14天诱导出的NK细胞的转染效率的方法,探索慢病毒感染NK细胞的最佳时机。4、培养3种前列腺癌细胞株PC3,LNCaP,DU145,转基因细胞和前列腺癌细胞株的效靶比分别设置为0.1:1、0.5:1、1:1、2:1、5:1、10:1、15:1、20:1,对比在这些效靶比下的杀伤效率。结果:1、流式细胞仪检测到的NK细胞的比例从第0天的(6.68%±1.57%)增加到第14天的(80.58%±7.51%)。2、通过倒置荧光显微镜观察293FT细胞均发绿色荧光,因此三载体系统包装制备慢病毒和PEG-8000慢病毒浓缩法成功。3、成功制备PSMA-CAR-NK细胞,PBMC培养3天诱导出的NK细胞转染效率高于14天的转染效率,慢病毒感染NK细胞应在NK细胞培养早期进行。4、PSMA-CAR-NK细胞为效应细胞与靶细胞(前列腺癌细胞株)比例为20:1时杀伤效率最高。结论:此实验研究结果VP-16展示了多种细胞因子诱导方法在体外培养的NK细胞具有较高的纯度和活性,慢病毒对培养早期的NK细胞转染效率较高,PSMA-CAR-NK细胞对前列腺癌细胞株具有较高的杀伤效率,作为一种新型的抗前列腺癌免疫治疗平台具有巨大的前景,为下一步体内杀伤实验提供了研究基础。

将富马海松酸三(β-丙烯酰氧基乙基)酯(FATE)通过自由基聚合反应键合到烷基化硅胶(TPM-SiO_2)表面，制备了核壳型松香基高分子键合硅胶(RP@SiO_2)固定相，对RP@SiO_2固定相进行了一系列表征和评价，探讨了RP@SiO_2柱对紫杉醇(opioid medication-assisted treatmentPTX)及其类似物的分离性能和分离机理，并将其用于红豆杉树皮粗提物中PTX的分离纯化。结果表明：FATE成功键合在硅胶表面，核壳型结构材料成功制JNJ-42756493试剂备，RP@SiO_2的平均粒径约为5μm;www.selleck.cn/products/ly2157299 RP@SiO_2柱是类似于C18柱的典型反相色谱柱，表现出优异的色谱性能、良好的重现性和典型的反相色谱行为；采用RP@SiO_2柱分离紫杉醇类似物，连续洗脱样品的分离度均超过6.6。计量置换保留理论(SDT-R)和van’t Hoff热力学分析结果表明：疏水相互作用决定了分析物的保留，在RP@SiO_2柱上分离紫杉醇类似物是一个焓驱动的放热过程，SDT-R可用于解释其保留机理。采用RP@SiO_2柱从红豆杉树皮粗提物中分离纯化紫杉醇，紫杉醇的纯度由6%提高到81%。

近几年,随着国家经济的迅速发展,综合国力的增强,以及经济结构的不断调整,高技能人才需求大幅提升,高职技术教育再次受到人们的重视。2021年中央办公厅、国务院办公厅颁布《关于推动现代职业教育高质量发展的意见》,明确指出,坚持立德树人、德技并修,推动思想政治教育与技术技能培养融合统一。在这一重大背景下,为促进高质量技术人才的培养,高职学生的全面发展问题引人注目。INCB28060其间,高职学生心理健康是促进其全面发展的关键一环。心理健康与高职学生的家庭关系、身心健康、全面发展等多种期待密切相关,在地区经济和社会发展中,对技术技能人才的需求量越来越大的情况下,怎样才能将具有身心健康特征的高素质技术技能人才培育出来,是一个迫切需要进行深入研究的问题。基于此,以江西省为样本分析该地区高职学生心理健康现状,对高职院校学生心理健康状况的影响因素进行分析,探讨提高高职院校学生心理健康状况的对策,并提出有针对性的对策,这对减轻高职院校学生的消极情绪,提高这一群体的心理健康状况具有现实意义。本研究问卷调查开展于2022年3月江西省新型冠状病毒肺炎疫情封校期Tofacitinib研究购买间,以江西省内高职院校学生作为研究对象。本研究主要通过调查问卷进行数据收集,对影响高职学生心理健康水平这一因变量的相关因素进行数据分析,以期提出有效促进高职学生心理健康的相关建议。通过SPSS软件对所收集的数据进行描述性统计、差异性检验、相关分析和回归分析。结果发现:男性高职学生心理健康水平高于女性高职学生;高年级高职学生心理健康水平低于低年级高职学生;对自己就业的看法、未来五年是否有清晰规划、对未来有信心、家庭年收入、家庭教养方式、近亲是否有过心理健康方面的问题以及主观支持、客观支持、对支持的利用度都对高职学生心理健康水平具有显著影响;目前最大困扰为学业压力、身体健康、时间管理、家庭经济困难、父母感情不和、与父母沟通障碍以及有效压力缓解活动为阅读喜欢的文学作品、规律作息、饮食有节、与家人聊天对高职学生心理健康水平具有显著影响。依据上述分析结果,本研究从个人因素、家庭因素和社会支持三个Medicare Provider Analysis and Review层面,提出促进高职学生心理健康水平行之有效措施,为我国培育德才兼备的高素质的职业技术人才人才打下了坚实的基础。

随着新精神活性物质在全世界范围内的蔓延，在查缉现场对疑似新精神活性物质样品进行快速定性分析是一线缉毒工作人员的迫切需求。卡西酮类物质属于卡西酮的衍生物，是新精神活性物质中的第二大类别。采用便携式拉曼光谱仪分析了70种卡西酮类化合物的拉曼光谱图，系统总结了卡西酮类物质的拉曼光谱特征，这些特征将有助于对未知telephone-mediated care卡西酮类物质的识别。所有卡西酮类化合物在（1 597±19）和（1 676±16)cm~(-1)处均存在由于苯环C=C键和C=O键伸缩振动产生的高强度拉曼峰，该特征可用于卡西酮类物质的识别。苯环上单取代和1,3-二取代卡西酮类化合物在992～1 000cm~(-1)处存在由苯环上C—H面内变形振动引MK-4827起的最强拉曼峰。3,4-亚甲二氧基取代卡西酮类化合物在（712±9）、（809±5）、（1 250±16）、（1 355±9）、（1 444±12）、（1 597±19）和（1 676±16)cm~(-1)有高强度拉曼峰，且（1 PF-6463922生产商597±19)cm~(-1)位置的峰为肩峰。通过对70种卡西酮类化合物的拉曼光谱逐一相互比对，考察了拉曼光谱对于各种位置异构体和结构类似物的区分度。结果表明，拉曼光谱对绝大多数卡西酮类物质具有较高的区分度，特别是对苯环上甲基、卤素、甲氧基不同位置取代的位置异构体区分显著，这也是拉曼光谱对比于气质联用法和液质联用法的显著优势。拉曼光谱对于部分烷基取代基不同的结构类似物区分度较弱，但通过特征峰也能实现区分。采用拉曼光谱法对实际案件缴获样品进行了分析，除部分样品存在荧光干扰无法识别外，其他样品的拉曼分析结果与气质联用法分析结果高度一致，证明了方法的可靠性和适用性。便携式拉曼光谱仪具有操作简单、测样速度快、可进行非接触式测样等优点，可用于新精神活性物质现场快速筛查分析。

坦布苏病毒(Tembusu virus,TMUV)属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus),有包膜、不分节段的单股正链RNA病毒,通过蚊媒传播,主要感染鸭,雏鸭、产蛋鸭易感,育成鸭有一定的抵抗力,还可感染鸡、鹅等,主要引起蛋禽产蛋下降,给养禽业带来较大的经济损失。本研究根据课题组从临床鸭病料中分离获得并提交至NCBI的鸭坦布苏病毒(Duck tembusu virus,DTMUV)CQW1株(登录号:KM233707.1)基因序列及Gen Bank上金黄色葡萄球菌核酸酶(Staphylococcus aureus nuclease,SNase,登录号:CP006630.1)序列,设计编码DTMUV衣壳蛋白(Capsid,Cap)和SNase基因的特异性引物,分别对Cap和SNase进行扩增、融合、构建融合重组质粒、融合蛋白稳定细胞系并开展体内外抗DTMUV的研究,结果报道如下:1.DTMUV Cap与SNase融合蛋白生物学特性分析为探究SNase的抗病毒效果,将DTMUV Cap与SNase进行融合,获得目的片段Cap-SNase和Cap-Linker-SNase,并构建真核重组质粒pcDNA3.1(+)-Cap-SNase和pcDNA3.1(+)-Cap-LinSCH772984临床试验ker-SNase,于BHK21和DEF细胞中进行表达与定位检测,通过DNA降解和MTT法分别检测融合蛋白的酶活性和细胞毒性,并于BHK21和DEF细胞中进行抗DTMUV试验。结果显示:融合蛋白Cap-SNase和Cap-Linker-SNase主要于细胞质中表达,热处理的蛋白经DNA降解试验发现,随着蛋白量递增,Cap-SNase和Cap-Linker-SNase均表现出越明显的降解DNA作用,相同蛋白量,Cap-Linker-SNase降解DNA的效果优于Cap-SNase;表达融合蛋白Cap-SNase和CMDV3100说明书ap-Linker-SNase的BHK21和DEF细胞形态、死亡情况与阴性对照组无差异,MTT法检测发现表达Cap-SNase和Cap-Linker-SNase的BHK21和DEF细胞活性较阴性对照组细胞活性无差异。抗病毒结果显示,在病毒感染48 h、60 h、72 h、84 h,BHK21和DEF细胞Cap-SNase和Cap-Linker-SNase组产生子代病毒的载量较阴性对照组均有不同程度下降。以上结果表bioinspired design明,融合蛋白Cap-SNase和Cap-Linker-SNase具耐热性和核酸酶活性但无细胞毒性,且表现出抗DTMUV的作用。2.DTMUV Cap与SNase融合蛋白稳定细胞系构建、特性分析及体外抗DTMUV效果探究为持续性探究融合蛋白抗DTMUV效果,利用慢病毒构建单克隆细胞系,从基因和蛋白水平检测其稳定性,用DNA降解法检测细胞系表达的融合蛋白Cap-SNase和Cap-Linker-SNase的酶活性,并对单克隆稳定细胞系开展抗DTMUV试验。结果显示,阳性单克隆细胞系即使传至80代,仍能检出目的基因和目的蛋白;DNA降解试验发现,随着蛋白量递增(2.5μg、3.0μg、3.5μg),融合蛋白降解DNA现象越明显;稳定细胞系的细胞形态和状态与BHK21细胞无差异,抗病毒试验发现,BHK21/Cap-Linker-SNase组在36 h、48 h、60 h病毒载量较对照组下降约10~(0.5)倍,而Cap-SNase组抗病毒效果不明显。以上结果说明,构建的单克隆细胞系BHK21/Cap-SNase和BHK21/Cap-Linker-SNase能稳定遗传和表达,且表达的融合蛋白Cap-SNase、Cap-Linker-SNase均具有耐热性和核酸酶活性,整合至BHK21的融合蛋白为细胞耐受,无细胞毒性,但细胞系表达的融合蛋白无明显的抗DTMUV效果。3.以慢病毒为载体的融合蛋白体内抗DTMUV探究为进一步探究融合蛋白Cap-SNase和Cap-Linker-SNase在鸭体内抗DTMUV的效果,以慢病毒为载体,将携带融合蛋白的慢病毒浓缩后感染7日龄鸭胚,将鸭胚孵化成雏鸭,再用DTMUV感染7日龄雏鸭13 d后收集鸭粪便,采集血液、内脏组织(心、肝、脾、肺、肾、脑),通过病理观察、RT-q PCR、体重监测等试验检测融合蛋白于鸭体内抗DTMUV的效果。病理切片观察结果显示,融合蛋白Cap-SNase和Cap-Linker-SNase能缓解DTMUV感染导致鸭心、肝、脾、肺、肾、脑组织出血等病理症状;RT-q PCR结果显示,融合蛋白组鸭血液、组织(脑、脾)中病毒载量和粪便排毒量显著低于1640和lentivirus-PHBLV组的病毒载量和粪便排毒量;体重监测结果显示,DTMUV感染导致鸭生长迟缓,而融合蛋白能缓解该现象。以上结果表明,融合蛋白Cap-SNase和Cap-Linker-SNase在鸭体内具有抗DTMUV的效果。综上,本研究通过将DTMUV Cap与SNase进行融合,开展体内外抗DTMUV的研究,体外瞬时表达的融合蛋白表现出抗DTMUV效果,稳定细胞系表达的融合蛋白无明显的抗DTMUV效果,以慢病毒为载体的融合蛋白于鸭体内表现出抗DTMUV效果。

株高是由作物节间长度与茎节数共同决定,是影响株型的重要因子。作物株型是决定产量的重要农艺性状,株型的改良已在作物产量的突破中起到至关重要的作用。目前苦荞高产育种严重滞后于大宗粮食作物,产量亟待提高。因此,本文开展苦荞理想株型的生理与分子调控机制研究,旨在为解析苦荞生长发育规律同时指导高产理想株型育种。本试验以~(60)Co-γ辐射诱变获得的节间长突变体ein1为材料,野生型晋荞麦2号(WT)为对照,开展表型鉴定、细胞结构特征观察、农艺与产量性状调查、外源激素响应、内源激素检测、转录组分析等研究,主要结果如下:(1)表型观察发现,苗期苦荞ein1突变体生长迅速、节间伸长、株高显著增加,但成熟时茎秆节数减少,株高显著降低,该表型稳定遗传。此外,ein1突变体叶夹角较WT明显缩小,株型紧凑、冠层更为合理,具有耐密植潜力。(2)细胞结构观察发现,苦荞ein1突变体茎秆细胞较WT明显增大,其长度与宽度均明显增加,表明苦荞ein1突变体的节间伸长与细胞膨大密切相关。(3)田间试验证实ein1在生育期前期株高显著高于WT,但灌浆后节数增速缓慢,成熟期株高显著降低,分枝数显著减少。ein1的千粒重与产量显著高于WT,其中产量高达3.4 t/hm~2,较WT增产34.62%。表明苦荞ein1具有株高降低、籽粒充实度好、产量增加等优异性状。(4)外源激素处理发现,ein1节间长度受GA_3的诱导而伸长,受PP_(333)抑制而缩短,表明ein1是GA敏感型突变体。GA_3和PP_(333)处理下ein1株高均显著高于WT。PP_(333)处理下ein1株高与喷施H_2O的WT株高相当,喷施H_2O的ein1株高与喷施GA_3的WT株高相当,而喷施GA_3的WT叶夹角变小,推测ein1节间伸长和叶夹角可能受GA调控。(5)LC-MS/MS共鉴定到16种GA类物质,其中4种GA类激素在ein1和WT间差异显著。ein1中GA_(34)、GA_4和GA_3激素含量分别为WT的6.91、2.85和1.18倍,而GA_(20)含量为WT的0.33倍。其中GA_4和GA_3具有明显生物活性,因此认为它们是调控ein1节间伸长的主要GA类激素。(6)对ein1茎进行转录组分析,结果发现ein1与WT间存在560个DEGs,包括了41个转录因子、3个GA合成与分解代谢、15个GA信号传导和25个茎发育与生长直接相关的DEGs。其中,GA20ox1表达量仅为WT的0.05倍,GA2ox表达量为WT的7.58倍。q RT-PCR证实ein1中GA20ox1表达量极低,而GA2ox表达量极显著提高,表明开花期ein1茎中GA的合成受到抑制,而GA的分解增强。购买MC3另外,q RT-PCR分析发现供试的12个基因的表达模式与转录组测序结果相符,证实转录组数据可靠。ein1中MYB32转录因子表达量提高;GA信号转导ATL6、PUB23、UNKL(Ft Pin G0003310400.01)和TIR1表达增高,WD repeat-containing protein 44、Ankyrin-2、RHA1B、UNKL(Ft Pin G0004799800.01)、RING-type zinc-finger、F-box and WD-40 domain protein 1/11、SCF ubiquitin ligase complex、26S proteasome regulatory subunit N10、26S pAZD1152-HQPA分子式roteasome regulatory subunit6B和26S proteasome regulatory subunit T3基因的表达则降低;茎生长发育相关基因CCR、CAD、CESA以及细胞壁相关的受体激酶均为上调表达,XTH、PL、BGALs下调表达,4个PE基因中3个下调表达、1个上调表达,8个纤维素酶相关的基因中,4个下调表达、4个上调表达。初步推测认为ein1中活性GA的积累会反馈抑制GA20ox1表达,导致GA_(20)含量下降,增强GA2ox表达,促进GA_4分解为GA_(34),并调节GA信号转导中12个泛素化连接酶基因和3个26S蛋白酶基因的表达,进而调控25个茎生长发育相关的基因表达,共同控制细胞的膨大和茎的伸长。综上所述,本研究发现苦荞ein1为节间伸长、节数减少、株型紧凑、籽粒充实度好的优异半矮杆高产突变体株系,其节间伸长受GA类激素的过量积累调控。GA类激素可能通过控制信号转导和生长发育相关基因的表达,共同决定ein1的株型。但ein1中GA超量积累的原因尚不清楚,以及GA的超量积累是否影响信号转导、茎生Bedside teaching – medical education长相关基因的表达有待进一步探究。

金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)是一种能够导致金黄色葡萄球菌肺炎的条件致病菌。抗生素滥用和金葡菌具有易产生耐药性的特性导致耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)等耐药金葡菌的广泛流行。因此,临床急需新型抗感染策略应对金葡菌肺炎。已有研究发现肠道菌群及其代谢物参与了肺脏细菌性感染的免疫调节,对耐药菌具有定植抗性,Trace biological evidence表明改善肠道微生物群是应对金葡菌肺炎的潜在治疗策略。植物化合物具有成本低、来源广和毒性低等特点,是抗细菌感染先导化合物发现的重要宝库。综上,从植物化合物中发现以肠道微生物群为靶点防治金葡菌肺炎的先导化合物具有重要意义。本研究首先通过实验治疗学研究考察不同浓度植物化合物-二吲哚甲烷(DIM)对金葡菌肺炎的预防作用。结果发现连续灌胃DIM(100 mg/kg、200mg/kg和400 mg/kg)14天对感染金葡菌肺炎小鼠均有良好的预防作用,其中200mg/kg DIM可显著降低金葡菌肺炎小鼠肺组织载LY294002 NMR菌量(P<0.01)和炎性反应(IL-6,P<0.05;IL-1β、TNF-α,P<0.01),有效缓解肺组织病理性损伤和肺水肿。本研究进一步通过最小抑菌浓度试验和生长曲线分析验证DIM对金葡菌的抗菌作用,结果发现DIM对受试金葡菌的MIC均大于1024μg/m L,在不高于256μg/m L浓度范围内对MRSA USA300生长无显著抑制作用,表明DIM对金葡菌无直接抑菌作用。此外,在细胞水平上发现DIM(不高于128μg/m L)对宿主细胞(A549细胞)无显著的药物毒性。应用HPLC测定小鼠粪便、血液和肺组织中DIM含量,分析药物在小鼠体内的吸收和代谢情况,结果发现在停止灌胃DIM 48 h后的小鼠粪便、血液和肺组织样品中均未直接检测到DIM残留,且低于检测限量(0.1μg/m L)。上述研究表明DIM是基于非病原靶向发挥预防金葡菌肺炎作用。综上,本研究进一步探究DIM靶向肠道抗金葡菌肺炎作用及其潜在机制。试验发现,连续14天灌胃200 mg/kg DIM对小鼠体质量变化、饮食饮水量和肝脾肾脏器器官均无显著影响,表明DIM在有效给药浓度下对小鼠无显著毒性作用。本研究通过建立小鼠肠道菌群失调动物模型验证DIM调节肠道菌群预防金葡菌肺炎的潜在作用,结果显示DIM可显著降低肠道菌群失调小鼠肺脏载菌量(P<0.01),缓解肺组织病理性损伤,显著降低金葡菌感染所致的肺水肿(P<0.01)。此外,金葡菌感染导致菌群失调组小鼠肺脏中MPO和ROS含量显著升高(P<0.01),而DIM处理可显著降低MPO和ROS含量(P<0.01)。炎症信号通路分析(蛋白免疫印迹试验和ELISA试验)结果发现金葡菌感染导致小鼠肺组织MAPK炎症信号通路的激活,磷酸化JNK和p38蛋白表达量明显升高(P<0.01),而DIM处理可显著降低磷酸化JNK和p38蛋白的表达(P<0.01)以及缓解金葡菌介导的炎性反应(TNF-α,P<0.05;IL-6、IL-10,P<0.01)。经过免疫荧光和PAS染色试验证实连续灌胃DIM14天可有效降低抗生素造成的肠道紧密连接蛋白(ZO-1和Claudin-1)表达量和杯状细胞数量(P<0.01)。16s RNA高通量测序结果表明DIM处理组可显著改善小鼠的菌群结构(P<0.01),提高拟杆菌门、螺杆菌属等有益菌群比例。DIM介导的粪便移植显著降低肺脏载菌量(P<0.01)和炎性反应(TNF-α,P<0.05;IL-6、IL-10,P<0.01),缓解肺脏病理性损伤,证实DIM调节肠道菌群发挥预防金葡菌肺炎作用。本研究采用非靶向代谢组学技术分析进行差异代谢物筛选,结果发现与溶剂对照组相比,DIM处理可显著提高肠道中异阿魏酸(IFA)、霉酚酸(MPA)、氧化型谷胱苷肽(GSSG)和尿苷-5'-二磷酸二钠盐(UDPD)的富集,代谢物回补验证性试验证实补充IFA可显著降低肺脏载菌量(P<0.01),缓解金葡菌感染导致的肺水肿(P<0.05)及肺脏病理性损伤,有效预防金葡菌肺炎,抑制MAPK炎症信号通路的激活和炎症因子的表达。综上所述,本研究发现连续灌胃DIM(200 mg/kg)14天,能够调节小鼠肠道菌群,显著提高拟杆菌门、螺杆菌属等菌群的比例,增加IFA的产量,抑制小鼠肺脏MAPK信号通路的激活,降低肺组织内菌落定植和缓解肺脏病理性损伤,有点击此处效发挥预防金葡菌肺炎作用。本研究为靶向肠道菌群抗金葡菌肺炎感染提供了新思路和先导化合物,为进一步防治耐药性金葡菌感染提供一定理论依据。

低聚木糖是一类具有多种生物活性的低分子聚合物,其中木二糖和木三糖由于其特有的益生元、抗氧化等活性在食品、保健和医疗等领域应用广泛。木聚糖酶作为一种可特异性降解木聚糖的糖苷水解酶,在低聚木糖的酶法制备中起着关键作用。鉴于木聚糖酶催化水解木聚糖的水解产物聚合度与其结构稳定性、底物结合位点和整体能量紧密相关,本文从真菌中克隆表达了2个第十家族(GH10)的高温高比活木聚糖酶,基于理性设计从酶的区域柔性、底物结合位点优化以及整体能量优化,确定影响降解产物组成的关键氨基酸位点,通过定点突变进行分子改良,以期获得高产木二糖和木三糖的突变体,为酶法生产功能性低聚木糖提供技术支撑。主要研究结果如下:(1)基于柔性区域改造筛得催化降解榉木木聚糖高产木二糖和木三糖的木聚糖酶突变体S21Y/N318W。从真菌Hortaea werneckii中挖掘并表达了GH10家族高温木聚糖酶木聚糖酶Hwxyl10A,其催化降解榉木木聚糖的产物组成中木二糖和木三糖的占比达30%。通过理性设计增强两个关键柔性区域位点S21和N318的刚性,得到优势突变体VP-16分子量S21Y/N318W,其催化降解榉木木聚糖的产物中木二糖和木三糖的占比高达75.2%,比野生型提高45%;其比活EPZ-6438供应商达到1901 U/mg,显著高于野生型(p<0.05)。此外,突变体S21Y/N318W在75℃下的半衰期为102 min,较野生型提高16倍,表明其具有更好的热稳定性。突变体S21Y/N318W由于催化活性关键Loop区的柔性降低,其结构稳定性增强,产物特异性改变,因此木二糖和木三糖在榉木木聚糖降解产物中的占比大幅提高。(2)基于底物结合位点优化筛得催化降解榉木木聚糖高产木二糖和木三糖的木聚糖酶突变体S265A。从真菌Cladophialophora carrionii中挖掘并表达了GH10家族高温木聚糖酶Ccxyl10B,其催化降解榉木木聚糖的产物组成中木二糖和木三糖的占比达45%,其比活为2145 U/mg。采用酶-底物对接模拟和虚拟饱和突变技术,明确了该酶催化通道中的底物结合关键氨基酸位点S265,通过定点突变得到优势突变体S265A。相较于野生型,突变体S265A降解榉木木聚糖的产物中木二糖与木三糖的占比(65%)提高20%,且产物中没有聚合度为4及以上的其他低聚木糖;其比活(3277 U/mg)提高53%。分子动力学模拟分析表明突变体S265A的催化通道中心基团与榉木木聚糖降解产物中的高聚合度低聚木糖底物的亲和力增强,促使高聚合度组分降解为低聚合度组分,从而利于木二糖和木三糖等高值化产物分离。(3)基于整体能量优化筛得催化降解榉木木聚糖高产木二糖和木三糖的木聚糖酶突变体V126F。基于Ccxyl10B的同源建模结构,对影响其整体能量的关键氨基酸位点进行虚拟饱和突变,筛得优势突变体V126F。突变体V126F催化降解榉木木聚糖的产物中木二糖与木三糖的占比高达Coloration genetics74%,比野生型提高27%,与突变体S21Y/N318W无显著性差异,显著高于突变体S265A,且产物组成中没有聚合度4以上的其他低聚木糖。与野生型相比,V126F的半衰期(t1/2)为27 min,是野生型(8min)的3.3倍;其比活(2359 U/mg)提高25%。分子动力学模拟分析表明突变体V126F的整体均方根偏差低于野生型,酶的整体能量下降,其催化活性通道的空间位阻降低,结构稳定性得以加强,且残基变化使产物释放更快,因此其催化降解榉木木聚糖产木二糖和木三糖的效率更高。(4)构建海水预处理桑枝联用木聚糖酶突变体协同纤维素酶催化降解桑枝木聚糖高产木二糖和木三糖。以海水浸泡预处理桑枝,利用木聚糖酶与纤维素酶协同处理催化降解桑枝木聚糖。结果表明:预处理能够促进木质素的去除,突变体V126F与纤维素酶协同催化水解桑枝耗时最短(8 h),产糖量最高(18.89μmol/m L),协同度在2 h时达到最大值2.99,比野生型木聚糖酶与纤维素酶的协同度提高59%。在木聚糖酶突变体V126F与纤维素酶协同催化降解桑枝木聚糖的低聚木糖产物组成中木二糖和木三糖的占比达到71.5%,比已报道的桑枝降解低聚木糖产物占比(仅30%)提高41.5%。相比于榉木木聚糖原料,本文构建的海水预处理桑枝联用木聚糖酶突变体协同纤维素酶催化降解桑枝木聚糖制备木二糖和木三糖的方法操作简便,成本更低,效率更高。因此,突变体V126F与纤维素酶协同催化水解桑枝木聚糖高产功能性低聚木糖,有助提高生产效率,从而提高桑枝资源的利用率及其衍生产品的附加值。综上,本文通过对真菌来源的两种高温木聚糖酶Hwxyl10A和Ccxyl10B进行分子改良获得三个优势突变体S21Y/N318W、V126F和S265A,再通过酶学性质和水解特性筛到可用于降解桑枝木聚糖产木二糖和木三糖的突变体V126F,为探索改良木聚糖酶产糖特性和桑枝资源的多元化利用提供参考。

本文基于荧光共振能量转Gel Doc Systems移（fluorescence resonance energy transfer,FRET）技术设计构建纳米磷光探针。设计构建一种用于活细胞蛋白酶体实时活性检测的更多探针。主要设计思路为利用纳米金和铱金属配位化合物之间产生的FRET现象，通过目标蛋白酶的底物多肽连接二者。纳米磷光探针中的上述底物多肽被相应的蛋白酶体特异性识别和切割。FRET供体（铱）配合物与FRET受体（金纳米颗粒）分离，导致FRET现象消失，呈现铱配位配合物的绿色磷光信号。本研究所设计纳米探针针对蛋白酶体（目标蛋白）产生的磷光信号与其酶活性呈正相关，可用于试管和活细胞水平的蛋白酶体活性检测。此外，本研究中所述的酶活检测探针，针对不同的蛋白酶活性检测具有灵活的转变能力，通过多肽序列的替换，可获得目的蛋白酶活性检测磷光探针，大大拓www.selleck.cn/products/dinaciclib-sch727965展了其应用。