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目的 探讨膨胀止血材料在战创伤急救中的应用价值。方法 体外物理性能评价中，将聚乙烯醇（PVA）和聚醚酯-氨基甲酸乙酯（PEEC）分别置于生理盐水、抗凝兔血及生理盐水与抗凝兔血1∶1混合液中，记录2种膨胀止血材料的体积、重量变化及体积压缩一半时所需压强。体内止血性能评价中，构建大鼠股动静脉损伤出血模型和兔肝损伤出血模型，观察无菌纱布、PVA和PEEC 3种止血材料对股动静脉损伤出血和肝损伤出血的止血效果；观察记录术后1 h和术后24 h总出血量、取出止血材料后1 min出血量、取出止血材料时粘连程度和难易程度。结果 在3种模拟体液中PVA的体积变化系数、体积变化速率均大于PEEC，重量变化系数小于PEEC(P均<0.01)，在生理盐水和抗凝兔血中PVA体积压缩一半所需的压强小于PEEC体积压缩一半所需的压强（P均<0.05）。术后1 h,2个动物模型实验中取出PVA时的粘连程度和取出难易程度均优于无菌纱布和PEEC；取出止血材料后1 min内仅无菌纱布组动物selleck激酶抑制剂见少量出血，PVA组、PEEC组动物均未见活动性出血。在股动静脉损伤出血模型中PVA组的术后1 h总出血量低于PEEC组（P<0.01），在肝损伤出血模型中术后1 h总出血量PVA组高于PEEC组（P<0.01）。术后24 h,2个动物模型实验中取出PVA时的粘连程度和取出难易程度均优于无菌纱布，PEEC大部分被降解，无法取出；取出止血材料后1 min内，无菌纱布、PVA、PEEC组动物均未见活动性出血。在股动静脉损伤出血模型中无菌纱布组与PVA组的24 h总出血量差异weed biology无统计此网站学意义（P>0.05），在肝损伤出血模型中PVA组的24 h总出血量高于无菌组纱布组（P<0.01），在2个动物模型中PEEC组术后24 h总出血量均见少量出血，无法计算出血量。在股动静脉损伤出血模型中，PVA组止血材料附近肌肉组织周边浸润的炎症细胞少于无菌纱布组和PEEC组。结论 PVA和PEEC均可通过吸收包括血液在内的体液使自身体积膨大控制股动静脉损伤出血和肝损伤出血，为战创伤救治新装备的研发提供了新的选择。

目的:病毒性肝炎是一个全球性的健康问题。乙肝(hepatitis B,H此网站B)、丙肝(hepatitis C,HC)都是肝脏相关死亡不容忽视的原因。另外COVID-19是否导致肝脏功能损伤也存在争议。本研究旨在探讨和分析近十年来HB、HC、COVID-19与肝损伤领域的优秀文献,确定其发展趋势和研究热点,并梳理学科知识库,为帮助科学研究提供新的启示。方法:在Web of Science Core Collection(Wo SCC)中分别检索2013年1月1日至2022年12月31日有关HB、HC、COVID-19与肝损伤有关的论文。选取original article和review作为这项分析研究的基础。按照被引用次数从高到底排序,取前1000条记录进行分析。文献计量可视化通过VOSviewer和Cite Space进行,并分别对HB、HC、COVID-19与肝损伤研究的国家、机构、作者的产出、合作关系、研究热点、前沿趋势进行分析。结果:(1)HB研究中,共有86个国家和1643个机构做出贡献。中国的科学产出最多(43.4%),前10所机构中有9所位于中国,并与美国形成了广泛的合作。《Hepatology》发表HB相关文章最多(n=116)。发文量前10的期刊中,《Gastroenterology》影响因子(impact factor,IF)最高(IF=33.883),拥有较高的学术质量。Zoulim F是最多产的作者(n=27)。肝细胞癌、感染、表面抗原、治疗、拉米夫定等高频共现关键词代表了研究热点。核苷酸类似物疗法、指南、闭合环状DNA、乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)核心相关抗原、表观遗传调控、固有免疫、乙肝病毒X蛋白这些最近的突现关键词代表了研究前沿。未来的研究将仍然聚焦于HB的治疗,特别是临床治愈。(2)HC研究中,前1000篇文章分布在81个国家和1916个机构中。美国与法国合作密切。美国发文量最多(56.6%),前10所机构中有9所位于美国,是HC研究的主要驱动力。《Hepatology》发文量最多(n=134),被引用频率最高。《Annals of Internal Medicine》发文量排名第五,但IF最高(IF=51.598)。Dore GJ是最多产的作者(n=29)。感染、持续病毒学应答(sustained virologic response,SVR)、利巴韦林、索非布韦、肝细胞癌等高频共现关键词代表过去十年的HC研究热点。最近的突现关键词如索非布韦、雷迪帕韦、开放标签、直接抗病毒药物、注射毒品等为近年来的研究前沿提供了线索。格卡瑞韦治疗HC相关研究将是未来最大的热点。(3)共有41个国家和308所机构参与COVID-19与肝损伤的研究。中国(40%)贡献最多,其次是美国(18.33%)。发表相关文章最多的是《World Journal of Gastroenterology》(n=8,IF=5.374)。各作者的贡献暂无明显差异。COVID-19、肝损伤、SARS-Co V-2、预后等高频共现关键词代表研究热点。COVID-19与肝衰竭的研究可能成为前沿。结论:(1)在对HB研究的可视化分析中发现,中美两国在过去十年形成了广泛的国际合作。现有的研究关注核苷酸类似物疗法、拉米夫定、HBV共价闭合环状DNNSC 119875供应商A、HBV核心相关抗原、表观遗传调控Pullulan biosynthesis、乙肝病毒X蛋白等相关问题。其治疗及干预策略是未来研究的主要趋势。(2)HC研究的可视化分析显示,美国是该领域研究的主要驱动力,主要与法国密切合作。直接抗病毒药物的应用并取得SVR是HC治疗的重点,目前相关研究主要关注索非布韦、雷迪帕韦、开放标签试验、注射毒品者等问题。格卡瑞韦的安全性及有效性是HC治疗的主要研究趋势。(3)目前COVID-19合并肝损伤的研究相对较少,SARS-Co V-2导致肝损害的证据尚不充分,主要机制可能是药物的使用、免疫系统的激活、细胞因子风暴等。由于其可能的长期肝损伤作用,需要更多研究为合并慢性肝病甚至肝衰竭人群的治疗提供建议。

目的：基于实时细胞分析（Real Time Cell Analysis，RTCA）技术对中药挥发性组分的细胞毒性及抗人腺病毒3型（Human Adenovirus 3，HAdV-3）的作用进行毒/效整合分析，构建抗病毒药物高通量筛选的新策略。方法：采用RTCA技术动态监测不同接种密度的A549细胞48 h生长曲线及10倍梯度稀释的HAdV-3感染A549细胞生长曲线，获得A549细胞最佳接种密度及HAdV-3最佳稀释浓度用于后续实验。以利巴韦林为阳性对照，基于RTCA技术采用曲线下面积（Area Under the Curve，AUC）方法对5种中药挥发性组分的细胞毒性及抗HAdV-3的作用进行毒/效整合分析，并与传统终点法数据处理进行对比。结果：终点法中艾叶、柴胡、薄荷、荆芥、牛蒡子、酸枣仁和利巴韦林对细胞的保护率分别为0.73%、12.50%、20.99%、44.50%、27.99%、51.50%和82.70%；AUC法中艾叶、柴胡、薄荷的选择性指数（Selective Index，SI）为负数，分别为-0.57、-0.21和-0.08。荆芥、牛蒡Belnacasan供应商子、酸枣仁和利巴韦林的选择性指数SI值分别为0.14、0.40、0.72和5.33。以利巴韦林的抗病毒活性为参照，终点法中酸枣仁、牛蒡子和荆芥的抗病毒活性为利巴韦林抗病毒活性的62.27%、33.85%和53.81%；AUC法中酸枣仁、牛蒡子和荆芥的抗病毒活性为利巴韦林抗病毒活性的13.51%、7.50%和2.63%。结论：传统终点法与本研究采用的AUC法计算结果有较大的差异。传更多统的抗病毒活性筛选研究多采用终点法检测受试药物对病毒感染细胞的保护作用，无法反映整个感染周期的变化，缺乏细胞毒的数据也会对结果的判断产生偏差。本研究提示基于RTCA技术对中药挥发性组分开展抗HAdV-3的毒/效整合评价，采用AUC方法计算药物的选择性指数作为高通量筛选新策略，能快速、精准地判断受试药物的抗病毒活性，具有准确性高Mobile social media，重复性好的优势。

为探究36份花椒资源间的遗传关系，本研究基于Illumina NovaSeq测序平台Urinary tract infection并利用ddRAD-seq (Double digest restriction site-associated DNA sequencing)技术对36分花椒资源进行了测序。结果显示，测序Q20值均值为98.00%，测序Q30值均值为93.72%，平均GC含量为36.01%；经过过滤和筛选共获得78 222 636个高质量SNP，其中纯合突变率平均值为91.17%；杂合突变率平点击此处均值为8.98%；SNP频谱分析显示碱基转换突变为主要SNP突变型。基于SNP进行的群体主成分分析、群体遗传结构分析以及群体发育树分析结果能够相互验证，可将36份花椒资源分为4个类群。在群体遗传AZD2281体内实验剂量多样性分析中发现，群体间的分化指数Fst在0.07～0.80之间，属于中等偏强且存在较大程度的遗传分化，遗传多样性差异较大。本研究利用ddRAD-seq技术解析的36份花椒资源群体遗传结构和群体遗传多样性，所筛选的SNP标记提供了丰富的信息，有助于完善花椒分子标记数据库，也为后续花椒遗传图谱构建、分子标记辅助选择育种、系统发育研究以及优良品种选育提供了基础。

猪链球菌溶血素(Suilysin,Sly)是猪链球菌(Streptococcus suis,S.suis)的主要毒力因子,其在猪链球菌的致病过程中发挥关键作用。前期研究发现钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(Ca~(2+)/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ,CaMKⅡ)是介导重组猪链球菌溶血素(Recombinant suilysin,rSly)细胞毒性的关键宿主因子之一,本研究旨在探究CaMKⅡ介导rSly诱导猪肾细胞(Porcine kidney-15,PK-15)凋亡的机制。一、rSly诱导PK-15细胞毒性的模型构建研究一是成功制备并鉴定了可溶性rSly。本研究以猪2型链球菌基因组DNA为模板,扩增出Sly毒力基因(1455 bp),通过构建p Cold I-Sly重组质粒,将其转入大肠杆菌BL21,18℃,180 r/min诱导表达24 h,经SDS-PAGE、Western blotting鉴定及溶血活性测定,制备了55 k Da的具有良好溶血活性的rSly。二是构建了rSly诱导PK-15细胞毒性的模型。将0、0.3、0.6、1.2、2.4和4.8μg/m L的rSly分别染毒PK-15细胞6、12及24 h,通过观察细胞形态、测定细胞存活Medicaid claims data率和LDH释放率,发现rSly毒性呈明显剂量效应。研究构建的rSly诱导PK-15细胞毒性的模型是:确定rSly对PK-15细胞染毒浓度是0.3和0.6μg/m L;确定rSly对PK-15细胞染毒处理时间为24 h;确定rSly对PK-15细胞染毒测定指标有:(1)细胞生长特点:细胞形态发生拉长、间隙增大;(2)细胞存活率:rSly染毒浓度为0.3和0.6μg/m L的细胞存活率分别为89.06%和53.06%;(3)LDH释放率:rSly染毒浓度为0.3和0.6μg/m L的LDH释放率分别为25.32%、33.61%。二、宿主蛋白CaMKⅡ介导rSly诱导PK-15细胞凋亡研究一是验证了CaMKⅡ介导rSly的细胞毒性作用。首先,用0.3和0.6μg/m L的rSly分别处理PK-15细胞24 h,Western blotting检测到rSly增加了CaMKⅡ磷酸化;其次,细胞形态学观察及细胞活力测定结果均显示,使用KN93抑制CaMKⅡ活性能显著减轻rSly诱导的细胞毒性,提高细胞存活率(P<0.01),说明CaMKⅡ介导了rSly诱导的ABT-199细胞培养细胞毒性作用;最后,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术分别在PK-15细胞上敲除编码CaMKⅡ四种亚型蛋白的CAMK2A、CAMK2B、CAMK2D、CAMK2G基因,rSly染毒4种基因敲除细胞,发现PK-15~(ΔCAMK2A)、PK-15~(ΔCAMK2B)细胞对rSly毒性的抵抗力增强,细胞存活率增加(P<0.01),揭示CaMKⅡ的α、β两种亚型在rSly诱导的细胞毒性中发挥主要作用。二是发现了CaMKⅡ可介导rSly诱导PK-15细胞凋亡。首先,通过测定凋亡、坏死性凋亡、自噬及焦亡的特征指标,发现rSly引起细胞死亡的主要途径为凋亡;其次,KN93抑制CaMKⅡ活性后,与rSly染毒正常PK-15细胞相比,AO-EB检测显示rSly诱导的细胞凋亡被抑制,且流式细胞术测定的细胞凋亡率降低了2.2倍,揭示CaMKⅡ可促进rSly诱导的PK-15细胞凋亡。三、宿主蛋白CaMKⅡ介导rSly诱导PK-15细胞的凋亡机制研究一是发现CaMKⅡ可介导rSly与细胞膜的结合。间接免疫荧光技术结果显示,抑制CaMKⅡ明显减少了rSly与PK-15细胞膜的结合。二是揭示CaMKⅡ可通过促进活性氧(Reactive oxygen species,ROS)生成从而促进rSly诱导的细胞凋亡。通过测定促凋亡因子ROS含量,结果显示抑制CaMKⅡ可显著减少rSly诱导的ROS生成(P<0.001),并利用ROS清除剂(N-aMK-2206配制cetyl-L-cysteine,NAC)预处理后显示NAC能够减少PK-15细胞凋亡,凋亡率降低了3.2倍,说明CaMKⅡ可通过促进ROS的生成从而促进rSly诱导的细胞凋亡。综上,本研究发现CaMKⅡ可促进rSly诱导的PK-15细胞凋亡,且CaMKⅡ是通过促进rSly与细胞膜结合以及ROS的生成来促进PK-15细胞的凋亡,这为今后继续深入阐明Sly的毒性机制提供了相应的理论依据。

目的探讨原花青素B2(proanthocyanidin B2,PC-B2)对过氧化氢(H_2O_2)诱导的小鼠星形胶质细胞(astrocytes,AS)氧化损伤和凋亡的保护作用及其机制。方法利用C57BL/6新生小鼠(1～3 d)分离、培养AS，通过筛选的H_2O_2和PC-B2最佳作用浓度分为正常组、正常+PC-B2组(100μg·mL~(-1) PC-B2处理24LY2157299价格 h)、H_2O_2模型组(200μmol·L~(-1) H_2O_2处理24 h)、H_2O_2+PC-B2组VX-661临床试验(200μmol·L~(-1) H_2O_2与100μg·mL~(-1) PC-B2共同处理24 h);CCK-8法检测各组细胞存活率，LDH法进行细胞毒性检测；ABTS和DPPH法检测PC-B2的抗氧化；ELISA试剂盒检测各组细胞中MDA含量以及SOD、CAT和GSH-Px活力；TUNEL染色法检测各组细胞凋亡情况；RT-PCR和Western blotting分别检测AS中Bax、Bcl-2、Caspase-3、Akt/Stat3、p-Akt、p-Stat3、Nrf2/HO-1的mRNA和蛋白表达水平。结果PC-B2能够明显增强细胞活力，抑制AS凋亡。并且与H_2O_2模型组相比，PC-B2干预能够显著降低AS中LDH、MDA含量，提高SOD、CAT和GSH-Px活力，抑制Bax、Caspase-3的mRNA和蛋白表达，上调AkWhole Genome Sequencingt/Stat3、Bcl-2、Nrf2/HO-1的mRNA和蛋白表达。结论PC-B2能够通过Akt/Stat3和Nrf2/HO-1途径增强AS抗氧化能力，减轻H_2O_2诱导的AS氧化损伤和凋亡。

本文将高通量测序技术应用于新型冠状病毒感染（COVID-19）的疫情防控当中，从基因组水平上了解新型冠状病毒（SARS-CoV-2）的分子学特征及变异情况，从而为疫情的防控提供科学的参考及准确的研判依据。我们选取2022年8月-9月庆阳市报告的Nirogacestat生产商新冠疫情本土感染者标本作为研究对象，对标本进行核酸检测和病毒全基因组测序并进行序列比对，使用MEGA分析软件基于邻接法构建病毒进化树，从而了解病毒的分子学特征及相关性。本研究所选取的9例病例均为普通型病例，核酸检测Ct值均较低。Nextclade分型结果显示：9条序列均属于21L型Omicron变异株；Pangolventral intermediate nucleusin分型结果显示：9条序列均处于Pangolin谱系中的BA.2.76进化分支上。与武汉参考株Wuhan-Hu-1(NC＿045512.2)相比，9条SARS-CoV-2序列的核苷酸同源性中位数为94.6%，核苷酸突selleck NMR变类型包括76～78个替换突变和3处缺失突变，氨基酸突变位点共涉及10个基因编码框，按氨基酸错义突变总数由多到少依次为：S蛋白区，ORF1ab区，N蛋白区，M蛋白区，E蛋白区和ORF3a、ORF6、ORF8、ORF9b区。进化分析结果显示：本研究获得的9条SARS-CoV-2全基因组序列处于Omicron变异株BA.2.76谱系。SARS-CoV-2在流行传播过程中，不断出现传播能力增强、抗体有效性降低及免疫逃避的新毒株，未来也将可能出现新的变异株，庆阳市首次将高通量测序技术应用到新冠病毒感染的疫情防控当中，从基因组水平上了解病毒的分子学特征，对监测庆阳市疫情防控及准确的研判具有重要意义。

目的回顾性分析近12年我院收治的终末期肾病(ESRD)患儿的临床资料,探讨儿童及青少年ESRD病因构成、临床特点、并发症、治疗与转归,为其预防、诊治提供参考。方法选取2010年1月～2021年12月在宁夏医科大学总医院儿内科及肾内科收治的54例ESRDFG-4592使用方法患儿为研究对象。收集临床一般资料、首诊原因、家族史、实验室检查、原发疾病、并发症、肾活检病理学、基因学检查、治疗和转归,严格按照纳入及排除标准筛选合格的临床病例,探讨ESRD的病因分布情况、并发症及治疗方式。组间比较采用卡方检验、校正卡方或Fisher′s确切概率法,P≤0.05有统计学意义。结果1.54例ESRD患儿中男性32例,女性22例,男女之比为1.45:1;年龄中0～6岁4例(7.41%),7～11岁14例(25.93%),12～18岁36例(66.67%)。初次就诊年龄6m～18岁,平均(10.9±4.9)岁;确诊年龄2～18岁,平均年龄(13±3.8)岁;确诊前病程中位数为0.17(0.02,1.7)年。46例来自宁夏,8例来自周边省份,农村地区30例,城镇地区24例,城镇:农村=0.8:1。2010～2015年收治ESRD患儿9例,2016～2021年收治ESRD患儿45例。2.病因构成中肾小球疾病24例(44.44%)居首位,以慢性肾小球肾炎为主;其他依次为先天性肾脏和尿路畸形(CAKUT)11例(20.37%),遗传性肾脏病5例(9.26%),其他病因5例(9.26%),病因不明9例(16.67%)。3.54例患儿首次就诊以肾脏相关症状起病的有15例,其中以浮肿、少尿(9例)最常见;肾外表现为首次就诊原因的有39例,以消化道症状最常见,呼吸道症状次之,少数患儿因其他疾病或体检而发现。4.ESRD最常见的并发症是贫血,54例患儿均伴有不同程度的贫血,发生率为100%,以中度贫血最常见。不同性别、年龄段及病因贫血的发生无差异(p>0.05)。其次为高磷血症(98.15%)、高尿酸血症(83.33%)、继发性甲状旁腺功能亢进(79.63%)、低钙血症(74.07%)、高血压(61.11%)、25羟维生素D缺乏(53.7%)、生长障碍(33.33%)及高钾血症(29.6%)等。5.54例患儿中有7例进行肾脏穿刺活检术,活检率为29.17%,其中原发性肾小球疾病有4例(FSGS 2例,FSGS伴Ig M 1例,Ig A肾病1例),继发性肾小球疾病有3例(过敏性紫癜肾炎IVb型2例、狼疮性肾炎V+Ⅲa/c型1例)。6.初次确诊后41例(75.90%)患儿行初始肾脏替代治疗,其中28例(63.00%)首选血液透析,10例(18.50%)首选腹膜透析,3例选择腹膜透析联合血液透析治疗;7例(13%)选择保守治疗;6例(11.1%)放弃治疗。13例患儿(24.07%)在透析治疗0.5～6年内行肾移植,其中1例2次移植后3年内死亡。7.54例ESRD患儿中目前继续随访32例(59.26%),其中12例行血液透析,8例行腹膜透析,12例行肾脏移植;失访8例(14.81%);死亡14例(25.93%),6例系放LGK-974 IC50弃治疗后死亡,6例死因为“感染”,4例死因为“心血管疾病”,2例死因为“呼吸衰竭”,2例死亡原因不明。结论1.本组病例中儿童及青少年ESRD发生于任何年龄,但在青春期儿童中占比最高,男孩高于女孩,农村地区高于城镇地区post-challenge immune responses。近6年收治的ESRD的患儿明显高于前6年。2.54例ESRD患儿病因构成中以肾小球疾病为主,以慢性肾小球肾炎占比多;其次为CAKUT。3.ESRD患儿首诊症状多样,无特异性,以肾外症状起病多见。4.54例ESRD患儿均有不同程度的贫血,以中度贫血为主;其次常见的并发症有CKD-MBD、高尿酸血症、高血压及生长障碍等。5.ESRD患儿肾脏替代治疗以血液透析为主,近年来行肾移植的人数呈增长趋势。6.感染和心血管疾病是ESRD患儿常见的死亡原因,位居首位的是感染。

由2， 4-二氨基-5-亚硝基-6-羟基嘧啶(DAHNP)还原为2， 4， 5-三氨基-6-羟基嘧啶(TAHP)并形成TAHP硫酸盐步骤繁琐，且会带入大量无机盐，对鸟嘌呤(GA)粗品纯化造成困难，直接从DAHNP出发合成GA不仅能够解决这一问题，而且还能缩短反应流程，提高反应效能，为此本文设计了一种甲酰胺法合成GA的绿色路线。本研究以氰ARV-associated hepatotoxicity乙酸甲酯(MC)和盐酸胍JAK/STAT抑制剂(GH)为原料，经环合、亚硝化一锅法得到DAHNP，分离得到的DAHNP经亚硫酸氢钠还原，与甲酰胺脱水闭环一锅反应得到GA。系统考察了反应原料的摩尔比、亚硝酸钠投料量、甲醇钠甲醇溶液质量分数等对DAHNP收率的影响；研究了不同还原剂种类、投料量以及甲酰胺溶液的质量分数等因素对GA收率的影响。以亚硫酸氢钠为还原剂，n(MC) : n(GH) : n(甲醇钠):n(NaNO_(2))=1 : 1.14 : 1.6 : 1.2，m(NaHSO_(3))为3.5g，80.0%甲酰胺溶液，20.0%甲醇钠甲醇溶液，GA收率可达81.0%，纯度≥99.0%。本合成工艺操作简便，流程简单，实现了甲酰胺溶剂的STM2457分子式回收利用，适于工业化生产。

多环大环内酰胺(polycyclic tetramate macrolactam,PoTeM)是一类具有特特拉姆酸结构单元及多环体系的大环内酰胺,其化学结构新颖、生物活性广泛,具有良好开发前景。PeToMs根据多环体系不同,分为5-5双环、5-5-6三环和5-6-5三环等结构亚型。生物合成研究发现,醇脱氢酶OX4负责5-5-6三环HSAF内侧六元环合成,醇脱氢酶CftD催化5-6-5三环ikarugamycin的内侧五元环合成。目前,PoTeMs相关醇脱氢酶尚无蛋白结构报道,OX4与CftD及其同源蛋白催化还原环化反应的分子机制和底物选择性机制尚未阐明。基于上述研究背景,本论文开展了以下三方面的工作:1.醇脱氢酶OX4三元复合物及CftD的晶体结构研究。通过蛋白的表达纯化、蛋白晶体筛选优化、以及晶体衍射数据收集处理,成功获得并解析三元复合物OX4-NADP+-3-deOH ATC(2.3 A)、OX4-NADP+-3-deOHATB(2.8 A)、OX4-NADP+-3-deOH HSAF(2.6A)、OX4-NADP+-Y1(3.2A)和 apo CftD(2.0 A)的晶体结构。结构分析发现,OX4和CftD属于非锌依赖的醇脱氢酶,每条链含有一个催化结构域和一个核苷酸结合结构域,二者被一个疏水的裂隙分开。OX4三元复合物中底物和NADPH以T字形结合在上述裂隙区域。2.醇脱氢酶OX4的催化机理。1)通过分析OX4中可能定位NADPH的氨基酸残基和NADPH相关突变体体外功能,推测OX4中的G169和K195决定其更倾向于利用NADPH。2)通过分析OX4三元复合物结构,确定NADPH供氢的烟酰胺环C4接近底物受氢的C21位,为OX4的底物区域选择性提供了结构支撑。3)通过对比分析三元复合物结构和底物相关突变体体外功能immune-based therapy,发现OX4反应中的氢化物转移和质子传递均无氨基酸残基介导,因此质子可能直接来自溶剂水;底物结合口袋的氨基酸残基除W260外,可能仅通过影响底物与蛋白的结合而影响酶活。4)由于OX4W260F和CftDW261A均仅催化双键还原反应,结合可能的反应中间体结构,推测该保守色氨酸可能通过与底物C-1位羰基形成氢键,稳定反应过程中的烯醇式过渡态。5)通过比对3-deOH ATC和3-deOHATB的三元复合物结构,发现底物立体构型不同导致其在复合物中的摆放方式不同,可能造成了 OX4的底物立体选择性。3.醇脱氢酶OX4与CftD的底物环系选择性机制。通过蛋白结构和序列对比,定位了三个可能影响醇脱氢酶OX4与CftD底物环系选择性的氨基酸loop区域,并构建了相应loop区域互换的OX4和CftD突变体。体外酶活显示,CftDLEE011突变体C-3的底物环系选择性转变为与OX4一致。由此,推测决定OX4与CftD底物环系选择性的氨基酸loop区域为 loop291-300MK-1775试剂(CftD 中为 loop292-301)。综上所述,本论文基于PoTeMs生物合成研究基础,通过开展醇脱氢酶OX4三元复合物和apo CftD的结构生物学研究和突变体体外功能评价,初步解析了 PoTeMs相关醇脱氢酶OX4和CftD独特的还原环化反应机理和底物选择性机制。本研究,不仅为同类蛋白结构的获取提供了经验,拓宽了对醇脱氢酶催化机制的理解,而且为后续PoTeMs多环体系改造提供了结构基础和理论依据。