非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种具有高传播率和高致病性的病毒性疾病,引起慢性或持续感染到急性出血热的各种症状,在猪群中死亡率接近100%,给全球养猪业遭受重大经济损失,目前尚无疫苗。ASFV p S273R蛋白酶是Sumo-1家族的一种特异性半胱氨酸水解酶,能够催化分解pp220和pp62多蛋白为小片段,组装合成核壳蛋白,在病毒复制过程中起到决定性的作用。因此确定能够有效影响ASFV p S273R蛋白酶活性的关键氨基酸位点,对于了解p S273R蛋白酶的生物学特性以及基于p S273R蛋白酶结构抗ASFV有效抑制剂的设计提供新思路,这对ASF的有效防治具有研究意义。本研究首先通过VMD软件对ASFV p S273R蛋白酶(Georgia 2007/1株)的三级蛋白结构进行预测分析,筛选出有效的影响酶活性的关键氨基酸位点,然后构建ASFV p S273R关键酶活位点突变后的重组载体,最后通过细胞酶活验证实验评价影响酶活性的关键氨基酸位点突变对ASFV p S273R蛋白酶活性的影响,并结合ASFV p S273R关键酶活位点突变后重组载体真核转染实验,分析ASFV p S273R关键酶活位点突变对细胞免疫表型的影响,全面了解ASFV p S273R酶活特性。VMD软件分析结果显示Cys232、Leu87和Lys167氨基酸为影响ASFV p S273R蛋白酶活性的关键氨基酸位点。在成功构建Flag-p S273R、Flag-p S273R-168H、FlagKD025p S273R-187N、Flag-p S273R-232C、Flag-p S273R-168H187N232C和Flag-p S273R-87L167K氨基酸突变体的条件下,将构建成功的FlaInfection ecologyg-p S273R-232C氨基酸突变体和Flag-p S273R-87L167K氨基酸突变体分别与重组载体HA-p P62共转染进293T细胞,Western Blot结果显示Flag-p S273R-232C突变体能够抑制p S273R蛋白酶酶活性,Flag-p S273R-87L167K突变体能够促进p S273R蛋白酶酶活性。真核转染实验的荧光定量PCR检测结果显示ASFV p S273R蛋白能够下调PAM细胞中免疫因子IFN-γ、IL-12和IFN-α的m RNA转录水平,与空白载体对照转染组差异性极显著(P<0.01)。Flag-p S273R-168H187N232C、Flag-p S273R-232C和Flag-p S273R-87L167K能够上调PAM中IFN-γm RNA转录水平,与Flag-p S273R转染组差异极显著(P<0.01)Staurosporine核磁。Flag-p S273R-168H187N232C和Flag-p S273R-232C均能够上调IL-12 m RNA转录水平,与Flag-p S273R转染组差异分别是极显著(P<0.01)和差异显著(P<0.05)。综上,pS273R-232C和pS273R-87L167K突变体是影响pS273R蛋白酶活性的关键氨基酸位点,Flag-p S273R-232C突变体能够从细胞水平抑制p S273R蛋白酶酶活性,Flag-p S273R-87L167K突变体能够从细胞水平增加p S273R蛋白酶酶活性,突变体均能够增加PAM的免疫表型,表明p S273R蛋白酶具有免疫抑制的特性。本研究为开展ASFV致病机制以及非洲猪瘟抑制剂开发提供新思路,为这对ASFV的有效防治具有研究意义。