鸭甲型病毒性肝炎是由鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus,DHAV)引起的雏鸭的急性、高度致死性传染病,是危害养鸭业的头号杀手。很长一段时期内,基因1型(DHAV-1)在我国鸭群中占主导地位。自2013年以来,基因3型(DHAV-3)传入我国并在鸭群中迅速传播。目前,DHAV-1与DHAV-3在鸭群中共同流行,而DHAV-3正逐渐占据优势流行地位。疫苗接种是鸭甲型病毒性肝炎防控的重要手段。目前,临床上主要使用DHAV减毒活疫苗与灭活疫苗进行鸭群的免疫接种与疫病防控。但是,传统的活疫苗selleck激酶抑制剂与灭活疫苗均高度依赖鸡胚,存在生产成本较高、内源病毒污染、生物废弃物产量大等缺陷。利用新型技术平台构建针对DHAV的病毒载体疫苗、亚单位疫苗、VLP疫苗、口服疫苗等新型疫苗也取得了较快的进展。其中,重组蛋白亚单位疫苗具有成本低、抗原表达量高、免疫原性较强等优势,是替代传统鸡胚化疫苗的最具潜力的疫苗类型。因此,本研究在杆状病毒表达系统中表达DHAV-3的主要保护性抗原VP1蛋白,并评价了重组杆状病毒灭活疫苗的免疫效力,旨在为鸭甲型病毒性肝炎疫苗的升级换代与疫病防控提供新的选择。本研究主要从以下三个方面开展:(1)建立DHAV-3病毒定量的荧光定量PCR方法与病毒的动物感染模型;(2)制备DHAV-3 VP1蛋白的单克隆抗体,并建立VP1蛋白定量的双抗夹心ELISA方法;(3)构建表达DHAV-3 VP1蛋白的重组杆状病毒,评价重组杆状病毒灭活疫苗在雏鸭中的免疫效力。本研究建立了 DHAV-3一步法荧光定量PCR方法与病毒的攻毒模型,建立了 VP1蛋白的双抗夹心ELISA方法,这些方法为后期疫苗的评价提供了技术支持。构建的重组杆状病毒可高效表达DHAV-3的VP1蛋白,重组杆状病毒灭活疫苗能够诱导雏鸭产生快速的抗体应答,并提供较好的临床保护。因此,本研究构建的表达DHAV-3 VP1蛋白的重组杆状病毒在研制DHAV-3亚单位疫苗方面具有一定的应用潜力,为DHAV-3疫苗的升级换代与疫病的防控提供了新的技术手段。1.DHAV-3一步法荧光定量PCR方法与动物感染模型建立病毒定量方法与动物感染模型的建立是进行候选疫苗评价的重要基础。本研究设计了一对针对DHAV-3 VP1基因的引物以及荧光探针,建立了一种基于TaqMan探针的一步法荧光定量PCR方法。该方法灵敏度较高,检测限为250 copy/μL,并被用于DHAV-3的分离培养与感染鸭组织病毒载量的测定。用一株DHAV-3临床分离株RY株建立了病毒的实验室培养体系。www.selleck.cn/products/iacs-010759-iacs-10759基于VP1氨基酸序列绘制的遗传进化树显示,RY株与近年来临床上流行的病毒亲缘关系较近。病毒可在SPF鸭胚、鸡胚与鸡胚成纤维细胞中复制,并可达到较高的病毒滴度。此外,以DHAV-3 RY株建立了病毒的动物感染模型。病毒感染可导致4日龄雏鸭的急性死亡,死亡率100%;病毒感染可引起典型的鸭肝炎症状与病变,病死鸭呈现典型的角弓反张姿势,肝脏严重出血、表面密布出血点;组织病理学观Specific immunoglobulin E察可见肝细胞大量死亡并伴有炎性细胞浸润。此外,RY株在肝脏、胰腺、肾脏、脾脏中有较高的病毒载量,说明病毒在鸭的多个器官内可高水平复制。因此,本研究建立的DHAV-3病毒定量方法、病毒的实验室培养体系与病毒的动物感染模型为后期开展DHAV-3疫苗的评价奠定了基础。2.用于DHAV-3 VP1抗原定量的双抗夹心ELISA方法的建立目前,主要通过测定病毒在鸡胚中的滴度来检验减毒活疫苗与灭活疫苗的抗原含量,但是能够用于蛋白亚单位疫苗抗原定量的方法较少。本研究的目的是制备针对DHAV-3 VP1蛋白的单克隆抗体,并建立VP1蛋白定量的双抗夹心ELISA方法,用于疫苗抗原含量的测定。以原核表达系统表达的VP1蛋白为抗原,免疫6周龄BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术制备VP1特异性单克隆抗体。经过3轮亚克隆筛选,共获得12株阳性杂交瘤细胞。选取部分杂交瘤细胞制备的腹水,除1D6以外,其余抗体的效价均高于60000,有的抗体效价高达6561000,说明制备的单克隆抗体与VP1蛋白的亲和力较强。间接免疫荧光实验显示,10株单克隆抗体可与DHAV-3感染的DF1细胞反应,说明获得的单克隆抗体可与病毒感染物反应。以单克隆抗体2C11为捕获抗体、VP1兔多克隆抗体为检测抗体建立的双抗夹心ELISA方法,与不同浓度的VP1蛋白标准品呈现良好的线性反应性(R2=0.993),检测限为12.5 ng。因此,本研究制备了针对DHAV-3 VP1蛋白的一系列单克隆抗体,并基于单克隆抗体建立了特异性好、敏感性强的双抗夹心ELISA方法,为蛋白亚单位疫苗抗原含量的测定提供了技术方法。3.DHAV-3 VP1蛋白在杆状病毒中的表达及其免疫效果评价本研究在杆状病毒表达系统中表达DHAV-3的保护性抗原VP1蛋白,并评价了重组杆状病毒灭活疫苗在雏鸭中的保护效力。利用不同策略构建了两株重组杆状病毒,rBac-VP1表达DHAV-3的VP1基因,rBac-conVP1表达通过生物信息学分析获得的VP1共有序列(consensus)。两株重组杆状病毒在Sf9细胞中的病毒滴度较高,遗传稳定性好,并可稳定、高效地表达VP1蛋白。rBac-VP1以1个MOI接种细胞时VP1表达量最高,rBac-conVP1以5个MOI接种细胞可达到较高的VP1表达水平。以重组杆状病毒接种的Sf9细胞制备抗原,用夹心ELISA方法测定抗原含量,rBac-VP1与rBac-conVP1感染细胞的表达产物中VP1蛋白含量分别为1.8 μg/mL和0.53 μg/mL。抗原经二乙烯亚胺灭活后与油佐剂进行乳化制备重组杆状病毒灭活疫苗。疫苗免疫雏鸭后1周即可诱导产生较高的VP1特异性抗体应答。DHAV-3攻毒后,未免疫鸭的生存率为40%;rBac-VP1免疫鸭的生存率为100%;rBac-conVP1免疫鸭的生存率为80%。因此,在杆状病毒中表达的DHAV-3 VP1蛋白具有较高的免疫原性与保护效力,能够诱导快速的抗体反应,并提供针对DHAV-3感染的良好保护。综上所述,本研究建立了 DHAV-3一步法荧光定量PCR方法、病毒的攻毒模型与VP1蛋白夹心ELISA方法,并构建了两株表达DHAV-3 VP1蛋白的重组杆状病毒。研究结果显示,在杆状病毒表达系统中表达的DHAV-3 VP1蛋白可诱导雏鸭产生快速的抗体应答,并提供针对DHAV-3感染的良好保护。本研究构建的重组杆状病毒对DHAV-3疫苗的更新与鸭肝炎的防控有较大的意义。