背景:抑郁症(Depression)以社交回避、快感缺乏、兴趣缺失、绝望和长期情绪低落为主要特征,并伴有植物神经功能紊乱的综合征。抑郁症发病机制复杂,与神经递质缺乏、炎症及神经营养因子失衡相关。其中脑源性神经营养因子(Brain derived neurotrophic factor,BDNF)与抑郁症的发生发展密切相关。BDNF可与酪氨酸激酶B(Tyrosine Kinase receptor B,Trk B)结合促进Trk B磷酸化并激活c AMP反应元件结合蛋白进一步增加BDNF水平,增加突触可塑性及神经发生调控抑郁样行为。瘦素(Leptin)经循环系统穿越血脑屏障激活Leptin受体(Leptin recptor,Lep Rb)发挥作用。临床研究显示,血清内Leptin水平与抑郁症状的严重程度呈负相关,且不同性别血清内Leptin水平也存在差异。在雄性啮齿类动物中,Leptin有较好的抗抑郁样作用。但雌性啮齿类动物存在雌激素水平及动情周期波动,发病机制更为复杂,其具体作用机制仍需进一步研究。综上,本研究基于卵巢摘除(Ovariectomy,OVX)抑郁小鼠模型及雌性慢性束缚应激(Chronic restraint stress,CRS)抑郁小鼠模型,进行Leptin在雌性小鼠抑郁样行为中的作用研究,并探讨Leptin能否通过调控BDNF的表达改善抑郁及其相关机制geriatric emergency medicine。目的:验证OVX及CRS抑郁造模方法在雌性小鼠中的应用,考察Leptin对OVX及CRS雌性抑郁小鼠的影响;在转录层面筛选Leptin对雌性小鼠抑郁样行为作用的可能机制;基于神经营养因子假说阐明Leptin能否通过调控BDNF的表达影响OVX及CRS小鼠抑郁样行为及其相关机制。方法:选取6-8周龄C57BL/6J雌性小鼠。通过手术摘除小鼠双侧卵巢建立围绝经期抑郁模型小鼠;通过将小鼠束缚于50ml离心管14天,每天6小时,建立CRS抑郁模型小鼠。依据分组,腹腔注射给予不同剂量的Leptin,或生理盐水作为相应对照。通过蔗糖偏好实验、旷场实验、悬尾实验和强迫游泳实验考察两种抑郁模型小鼠的抑郁样行为变化;通过酶联免疫吸附实验分别考察OVX及CRS对雌性小鼠血清内皮质酮水平的影响;通过免疫组织化学染色的方法,考察给药后小鼠内侧前额叶皮质(medial prefrontal cortex,m PFC)和海马(hippocampus,HP)内不同亚区中c-Fos表达量变化。建立OVX及CRS雌性小鼠抑郁模型,通过高通量测序的方法对小鼠海马内RNA-seq进行生物信息学分析,比较雌性抑郁模型小鼠与Leptin给药的雌性抑郁模型小鼠的不同基因表达特征,并进行GO基因功能富集分析和KEGG通路富集分析。建立OVX及CRS雌性小鼠抑郁模型,运用双重免疫荧光染色考察BDNF与Lep Rb在情绪相关脑区是否存在共定位,以及Leptin给药对BDNF与Lep Rb共表达的影响;通过RT-PCR考察情绪相关脑区Bdnf m RNA变化。通过免疫印迹实验考察BDNF、p Trk B/Trk B及Leptin通路蛋白表达变化。通过脑立体定位技术靶向HP齿状回注射AKT阻断剂,运用生物化学与分子生物学实验考察AKT阻断剂对雌性小鼠抑郁相关生化指标的影响。结果:1.绝望行为实验中两种模型小鼠不动时间延长,高剂量腹腔注射Leptin干预后两种模型小鼠不动时间缩短;考察两种模型m PFC及HP不同亚区内c-Fos的表达水平,模型组较假手术组/对照组相比c-Fos表达量降低,在OVX模型中,腹腔注射高剂量Leptin后,m PFC及HP内c-Fos表达量升高;在CRS模型(动情前期)中,m PFC区及HP的CA2、CA3及DG区c-Fos表达量升高。2.RNA-seq结果提示:OVX模型高剂量(5mg/kg)Leptin治疗与未治疗差异基因表达上调50个,下调84个;CRS模型高剂量(5mg/kg)Leptin治疗与未治疗差异表达基因上调27个,下调22个;上调基因主要显著富集树突棘形态和发生,而胰岛素信号通路是下调的明显富集通路。3.两种模型小鼠中,m PFC亚区(Cg1,Pr L,IL)及HP亚区(CA1,CA3及DG)中BDNF和Lep Rb存在共定位,模型组BDNF表达量降低,在OVX抑郁模型中,给予Leptin干预后Cg1,IL,CA1,CA3及DG区中BDNF表达量升高;在CRS雌性小鼠抑郁模型中,Cg1,CA3及DG亚区BDNF表达量升高。考察Bdnf m RNA表达,给予Leptin干预后两种模型小鼠海马区Bdnf m RNA表达升高。免疫印迹实验考察BDNF蛋白及下游通路蛋白水平,OVX抑郁模型中,高剂量Leptin腹腔注射后m PFC区的BDNF蛋白水平升高;中、高剂量的Leptin腹腔注射后HP中BDNF蛋白水平升高。在CRS抑郁模型中,给予高剂量Leptin腹腔注射后m PFC区的BDNF蛋白表达水平升高,动情前期腹腔注射中、高剂量Leptin后,HP区BDNF表达升高,磷酸化Trk B比值升高;动情后期腹腔注射高剂量Leptin后,BDNF和磷酸化Trk B比值表达升高。Leptin与Lep Rb结合可激活三条信号通路,给予高剂量的Leptin治疗后,HP内AKT磷酸化水平明显升高,表明HP内Leptin对小鼠抑郁样行为的改善作用可能是通过AKT信号通路介导的。脑立体定位技术靶向DG区给予AKT阻断剂微量注射,考察BDNF蛋白及下游通路蛋白水平。Leptin组小鼠Bdnf m RNA表达水平、BDNF及下游通路蛋白表达水平上升;AKT抑制剂+Leptin组小鼠Bdnf m RNAPLX5622生产商表达水平、BDNF及下游通路蛋白表达水平无升高。结论:1、Leptin可以改善OVX或CRS诱导的雌性小鼠抑郁样行为,逆转CRS或OVX诱导的雌性小鼠m PFC(Cg1、Pr L和IL)和HP(CA2、CA3和DG)内cFos表达减少。2、Leptin对雌性小鼠抑郁样行为具有改善作用与Bdnf的表达及PI3K/AKT信号通路的激活有密切关系,Leptin/AKT/BIBW2992BDNF信号通路激活是Leptin抗抑郁作用的关键机制。