华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)是一种重要的食源性寄生虫,成虫寄生于犬、猫和人等哺乳动物的肝胆管中,引起华支睾吸虫病。目前,该病全世界约有3500多万人感染,主要在东亚和东南亚流行。中renal biopsy国大约有1300万人被感染,黑龙江、吉林、广东和广西等27个省市均有流行,因此,对于华支睾吸虫病的防控刻不容缓。华支睾吸虫病诊断的金标准是通过粪检检出虫卵,但这种方法敏感性较低,容易造成漏检,不适合大规模临床检测,所以建立一种更为快速、准确、简便,且适用于大规模临床样本检测的诊断方法非常必要。本研究主要分为三个部分。(1)华支睾吸虫囊蚴的收集及标准血清的制备。本实验从麦穗鱼中分离出纯净的囊蚴,对日本大白兔和中华田园犬进行攻虫,制备华支睾吸虫标准阳性血清。(2)诊断抗原的分析和克隆表达及最佳诊断抗原的筛选。选择16LY294002小鼠 Ku calcium-binding protein(CBP16)、Dynein light chain-2(DLC2)、Glutatwww.selleck.cn/products/elexacaftorhione transferase omega-2(GST-2)和Paramyosin(PC2)4种具有诊断潜力的蛋白进行生物信息学分析,结果显示4种蛋白均具有良好的抗原性。随后对4种蛋白进行表达纯化,用以进行Western blot反应,结果显示四种蛋白均与兔华支睾吸虫阳性血清反应,且不与阴性血清反应,证实了四种蛋白均具有良好的诊断价值。将4种蛋白均以5μg/m L包被ELISA板,同时孵育阴性及阳性血清,对结果进行读数,发现DLC2蛋白的P/N值最高,达到4.13,表明DLC2蛋白为华支睾吸虫病诊断的最佳抗原。(3)华支睾吸虫快速诊断免疫层析试纸条的制备与初步应用。将DLC2蛋白以0.5 mg/m L浓度对检测线进行划线,以SPA为标记物进行偶联胶体金,质控线以1 mg/m L鸡抗SPA二抗进行划线,建立胶体金免疫层析(GICA)试纸条的方法,并分别对兔、犬、人的血清进行了稀释倍数的优化。建立的GICA法与日本血吸虫、肝片吸虫、日本棘隙吸虫阳性血清均不发生交叉反应,特异性较好,可用于临床样本的快速诊断。最后以建立的GICA法对临床样本进行了检测,结果显示宠物医院样本中阳性率为2.1%(5/138);流浪犬阳性率为5.6%(5/88)。本研究成功建立了犬感染华支睾吸虫的动物模型,并获取了大量华支睾吸虫病的标准阳性血清,成功地对4种具有诊断潜力的抗原进行了表达及纯化,最后通过ELISA进行筛选,选择P/N值最大的DLC2蛋白为抗原,建立了华支睾吸虫快速诊断免疫层析试纸条的方法。与传统虫卵相比,其敏感性更高,与商业的人华支睾吸虫试剂盒相比敏感性特异性相似。本研究为临床华支睾吸虫病的诊断提供了新的方法。