研究背景皮肤鳞状细胞癌(Cutaneous Squamous cell carcinoma,cSCC)是一种来源于鳞状上皮细胞恶性增生的皮肤肿瘤,被认为是第二大最常见的皮肤癌,占皮肤癌总发病率的20%～50%。紫外线的辐射、遗传易感性、免疫抑制以及与化学致癌物的长期暴露是导致cSCC发生的主要因素。cSCC导致的死亡占皮肤癌相关死亡的20%,早期的cSCC容易被患者忽视,若未及时治疗,瘤体会迅速增大,进而导致严重的并发症、累及局部淋巴结,以及发生远处转移,以至于影响患者的生存率。目前,对于cSCC的治疗首选手术切除,但手术切除存在破坏性大、易复发及复发后治疗困难等局限性。研究报道显示,对于晚期cSCC患者,即使是应用“程序性死亡蛋白-1(Programmedcell death 1 protein,PD-1)抗体,治疗有效率也不到50%,且在有效的病例中也仅有1/6的患者达到完全缓解。因此,cSCC已成为危害人类健康和生命安全的常见重大疾病,随着人口老龄化问题的不断加剧形势日趋严峻,且其发病机制迄今仍不明确。因此,深入探索cSCC关键发病机制为今后cSCC的精准治疗提供可靠靶点,同时寻求高效低毒的天然产物用于cSCC的治疗刻不容缓。本课题组通过对6例cSCC患者的肿瘤组织和癌旁组织内进行转录组学测序分析,发现色氨酸2,3-双加氧酶(Rryptophan 2,3-dioxygenase,TDO2)在cSCC患者的肿瘤组织的表达明显高于癌旁组织。TDO2是体内特异性催化色氨酸(Tryptophan,Trp)吲哚核发生开裂形成犬尿氨酸(Kynurenine,Kyn)的酶,主要在肝内表达,在一定的刺激情况下,也可以在其他组织如附睾、胎盘、脑以及妊娠子宫中表达。TDO2可以促进肿瘤的进展且具有泛癌性,在基底细胞癌、食管鳞癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌以及平滑肌肉瘤中均呈高表达,且TDO2表达越高患者预后越差。但迄今为止,TDO2在cSCC中表达情况及可能的生物学意义未见报道。雷公藤甲素是从雷公藤中分离出的一种环氧化二萜内酯化合物,可用于治疗多种肿瘤及免疫系统疾病,被《Cell》等论文列为最有可能开发成为现代药物的天然药用化合物之一。文献报道,雷公藤甲素可以抑制cSCC、肝癌、胰腺癌、胶质瘤等多种肿瘤的进展。其中,雷公藤甲素对cSCC的研究报道局限于雷公藤甲素可影响A431细胞的增殖、凋亡能力,以及影响A431细胞的细胞周期及相关基因的mRNA表达水平,但在蛋白水平上未进行深入研究,且具体调控机制未详细说明。研究目的针对cSCC发病机制不明,治疗上存在多种局限性的现状,本课题拟围绕上述的问题展开以下研究:1)分析TDO2在cSCC中的表达情况和模式,并分析其临床意义;2)分析TDO2促进cSCC进展的效应及具体分子机制;3)探索雷公藤甲素对cSCC的疗效及具体分子机制。拟通过本课题的开展,为进一步探索cSCC的发病机制及为未来在临床上使用高效低毒性的靶向天然产物治疗cSCC的提供可靠的实验依据。研究方法1.TDO2在cSCC中的表达以及临床相关性分析使用转录组测序技术揭示人cSCC组织与癌旁组织间的差异表达基因。通过实时荧光定量聚合酶链反应(Quantitative Real time-polymerase chain reaction,qRT-PCR)验证转录组测序所得的差异基因TDO2在cSCC组织中的mRNA表达水平。利用发表于《Cell》杂志的cSCC单细胞转录组公共数据GSE144240进行细胞分群,进一步分析TDO2在不同细胞中的表达情况。通过对cSCC组织进行免疫荧光染色,进一步验证TDO2在cSCC具体细胞类型中的表达情况。同时,我们收集了 45例经组织病理学确认的cSCC临床组织样本及患者的临床信息,对石蜡样本进行免疫组化染色,分析TDO2的表达与临床的相关性。2.TDO2促进cSCC进展的分子机制探索2.1分析TDO2的表达对成纤维细胞的影响对临床肿瘤标selleck Galunisertib本进行原代分离获得肿瘤相关成纤维细胞(Tumor-associated fibroblasts,CAFs),通过蛋白免疫印迹(Western blot,WB)实验验证所分离的原代细胞具有CAFs的表型及功能,以用于后续细胞实验。将TDO2抑制剂LM10加入CAFs中,通过CCK8法检测CAFs的细胞增殖能力、划痕实验检测CAFs的迁移能力、克隆形成实验检测CAFs的克隆形成能力。通过慢病毒感染成纤维细胞,构建TDO2过表达成纤维细胞株,通过qRT-PCR及WB实验验证慢病毒感染效率。通过CCK8法检测过表达TDO2的成纤维细胞增殖能力、划痕实验检测过表达TDO2的成纤维细胞的迁移能力、克隆形成实验检测过表达TDO2的成纤维细胞的克隆形成能力。2.2分析TDO2促进cSCC进展的作用及分子机制选用Transwell共培养板对成纤维细胞与cSCC细胞进行共培养,以用于后续实验。通过CCK8法检测cSCC细胞的增殖能力、划痕实验检测cSCC细胞的迁移能力、克隆形成实验检测cSCC细胞的克隆形成能力。通过对cSCC细胞进行转录组测序,探索TDO2促进cSCC进展的主要分子机制;通过WB实验对测序得出的关键分子机制进行验证。通过液相色谱-质谱联用(High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry,HPLC-MS)技术检测 TDO2 代谢产物Kyn的含量,通过CCK8法及EdU法检测Kyn对cSCC细胞增殖的影响,以及芳香烃受体(arylhydrocarbonreceptor,AhR)抑制剂对cSCC细胞增殖的抑制作用。通过WB实验验证Kyn/AhR促进cSCC进展的分子机制。通过测量小鼠的体重及肿瘤体积分析TDO2对SKH-1小鼠cSCC生长的影响,通过免疫组织化学染色分析各组小鼠肿瘤组织中增殖相关指标Ki67及PCNA的表达情况。3.分析雷公藤甲素对cSCC的疗效及分子机制通过CCK8法检测雷公藤甲素、丹参酮IIA及白藜芦醇对cSCC增殖的影响,通过HPLC-MS筛选可降低Kyn含量的中药,并通过WB验证TDO2的表达。通过划痕实验检测雷公藤甲素对cSCC细胞迁移能力的影响,通过克隆形成实验检测雷公藤甲素对cSCC细胞克隆形成能力的影响。通过流式细胞术检测雷公藤甲素对cSCC细胞的细胞周期及细胞凋亡的影响。通过WB实验验证雷公藤甲素影响cSCC细胞凋亡及细胞自噬的具体分子机制。通过小鼠体重变化分析雷公藤甲素治疗cSCC小鼠对其生长有无影响,并使用苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosinstaining,HE)检测治疗后小鼠组织器官是否受影响,以分析治疗安全性。研究结果1.TDO2在cSCC中的表达以及临床相关性分析通过转录组测序发现TDO2在cSCC组织中高表达,经qRT-PCR验证6对cSCC组织及癌旁组织中TDO2的表达,再次证实了 TDO2在cSCC组织中高表达,同时利用GEO数据库中的GSE84293公共数据集也得到了一致的结果。利用发表于《Cell》杂志的cSCC的单细胞转录组测序数据(GSE144240)进行分析,发现TDO2在CAFs中高表达;通过免疫荧光染色验证cSCC中TDO2的表达模式,显示TDO2的表达与CAFs表面标记物平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)高度重合,再次确证TDO2表达于cSCC的CAFs中。2.TDO2促进cSCC进展的分子机制探索2.1分析TDO2的表达对成纤维细胞的影响收集临床组织标本,通过原代细胞分离术对cSCC组织中的CAFs、以及癌旁组织中的成纤维细胞进行分离,通过qRT-PCR及WB实验检测分离获得的CAFs与正常的成纤维细胞的表面标志物,结果发现CAFs中α-SMA、成纤维细胞活化蛋白(Fibroblast activating protein,FPA)的表达高于对照组,表明所获得的原代成纤维细胞确为CAFs,可用于后续实验。在CAFs中加入TDO2抑制剂LM10后,通过CCK8法检测发现CAFs的增殖能力降低,通过划痕实验检测发现CAFs的迁移能力降低、通过克隆形成实验检测发现CAFs的克隆形成能力降低。通过qRT-PCR验证发现过表达TDO2的成纤维细胞中TDO2的mRNA表达水平远高于对照组,通过WB实验验证发现过表达TDO2的成纤维细胞中TDO2的蛋白表达水平远高于对照组,提示我们成功构建了过表达TDO2的成纤维细胞株,可用于后续实验。之后,通过CCK8法检测发现过表达TDO2的成纤维细胞的增殖能力增强,通过划痕实验检测发现过表达TDO2的成纤维细胞的迁移能力增强、通过克隆形成实验检测发现过表达TDO2的成纤维细胞的克隆形成能力增强。2.2分析TDO2促进cSCC进展的作用及分子机制通过CCK8法检测发现,与过表达TDO2成纤维细胞共培养后,cSCC细胞的增殖能力增强;与添加LM10的CAFs共培养后,cSCC细胞的增殖能力减弱。通过划痕实验检测发现,与过表达TDO2成纤维细胞共培养后,cSCC细胞的迁移能力增强;与添加LM10的CAFs共培养后,cSCC细胞的迁移能力减弱。通过克隆形成实验检测发现,与过表达TDO2成纤维细胞共培养后,cSCC细胞的克隆形成能力增强;与添加LM10的CAFs共培养后,cSCC细胞的克隆形成能力能力减弱。通过对与过表达TDO2成纤维细胞共培养的cSCC细胞进行转录组测序技术分析发现,PI3K/Akt信号通路在TDO2高表达组显示被激活,通过WB实验验证,结果显示,蛋白激酶B(proteinkinaseB,Akt)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,mTOR)、p70 核糖体蛋白 S6 激酶(p70 ribosomalprotein S6 kinase,p70S6K)、S6 核糖体蛋白(S6ribosomal protein,S6)的磷酸化表达水平均高于对照组。通过HPLC-MS检测添加LM10后CAFs中Kyn的含量,结果发现,添加抑制剂组Kyn的含量低于对照组;同时,通过HPLC-MS检测过表达TDO2的成纤维细胞中Kyn的含量,结果发现,TDO2过表达组Kyn的含量高于对照组。通过CCK8法及EdU法检测Kyn对cSCC细胞增殖的影响,结果显示Kyn可促进cSCC细胞的增殖。通过WB实验验证发现,与TDO2所激活的信号通路一致,Kyn组也显示激活了 cSCC细胞的PI3K/Akt信号通路,并且该通路的激活可被AhR抑制剂逆转,这提示我们TDO2可能是通过KynProtein Tyrosine Kinase抑制剂/Ahtumor suppressive immune environmentR轴激活PI3K/Akt信号通路,进而促进cSCC进展。通过测量小鼠的体重及肿瘤体积发现TDO2可促进SKH-1小鼠cSCC的生长,通过免疫组织化学染色检测发现在过表达TDO2的小鼠肿瘤组织中,增殖相关指标Ki67及PCNA的表达明显高于对照组。3.雷公藤甲素对cSCC的疗效及分子机制通过CCK8法检测发现雷公藤甲素、丹参酮IIA及白藜芦醇均可抑制cSCC细胞的增殖,通过HPLC-MS筛选经这三种中药处理后的CAFs发现,雷公藤甲素组显示相对最低的Kyn含量,同时,通过WB实验发现,经雷公藤甲素处理后,CAFs中TDO2的表达下降。通过划痕实验检测发现,雷公藤甲素抑制cSCC细胞的迁移能力。通过克隆形成实验检测发现,雷公藤甲素抑制cSCC细胞的克隆形成能力。通过流式细胞术检测发现,雷公藤甲素可诱导cSCC细胞的细胞周期停滞于G0/G1期,以及促进cSCC细胞的凋亡。通过WB实验分析发现雷公藤甲素促进cSCC细胞凋亡、诱导cSCC细胞自噬是通过抑制PI3K/Akt信号通路实现的。通过测量小鼠的瘤体大小发现雷公藤甲素可有效抑制cSCC荷瘤小鼠的肿瘤生长,且小鼠体重无明显变化,治疗后小鼠的重要组织器官(心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏)病理切片未显示明显异常。研究结论TDO2在cSCC组织中高表达,主要表达于CAFs中,TDO2的表达可影响成纤维细胞及cSCC细胞的增殖、迁移和克隆形成能力。TDO2通过Kyn/AhR轴激活PI3K/Akt信号通路促进cSCC的进展。雷公藤甲素通过降低TDO2的表达及其代谢产物Kyn含量,以及抑制PI3K/Akt信号通路的激活,从而抑制cSCC的进展。