目的:本研究为诠释当归生姜羊肉汤干预脾肾阳虚IBS-D的成分靶点和作用机制。利用网络药理学和分子对接预测其科学内涵的可能范畴,并采用代谢组学,肠道菌群16s rDNA高通量测序,结合生理生化指标检测等方法寻找相关科学佐证。方法:1.利用网络药理学方法并结合超高效液相色谱-线性离子阱-静电场轨道阱质谱联用技术(UHPLC-LTQ Orbitrap MS)筛选与分析药物成分、靶点、通路、疾病之间的关系网络并可视化,采用分子对接技术对其核心成分与潜在核心靶点亲和能力和结合模式进行验证,挖掘当归生姜羊肉汤作用于脾肾阳虚肠易激综合征的关键靶点和通路。2.以当归生姜羊肉汤为受试药物,观察当归生姜羊肉汤的30d喂养脾肾阳虚肠易激综合征实验大鼠的临床表现、生理生化,脏器病理变化等,结合BDI-GS评价体系,评价当归生姜羊肉汤对实验大鼠的影响。3.以雌性脾肾阳虚IBS-D成年大鼠作为实验对象,通过Image J图像分析软件对模型实验大鼠爪、尾、舌等进行分析,结合旷场实验等研究当归生姜羊肉汤对脾肾阳虚证候的临床变化。4.进行16s rDNA高通量测序技术获取肠道微生物多样性数据进行分析,并采用RT-PCR检测棕色脂肪中UCP、DIO2、S100b、AMPK等能量代谢和炎症相关基因表达情况的变化,探讨当归生姜羊肉汤改善脾肾阳虚肠易激综合征大鼠的疗效机制。结果:1.网络药理学和分子对接证实了当归生姜羊肉汤核心成分作用于IBS-D潜在核心靶点的可靠性当归生姜羊肉汤可通过姜酮、水菖蒲酮、棕榈酸、乌臼酸、β-红没药烯、β-谷甾醇、豆甾醇、油酸等8个核心成分作用于AKT1、INS、TNF、TP53、IL-6、E GFR、CTNBB1、IL-1β等8个潜在的核心靶点,经AGE-RAGE信号通路、c AMP信号通路、MAPK信号通路、IL-17信号通路、Ca M信号通路等通路,增加能量代谢促体温升高,抑制促炎因子的水平,缓解炎症反应,增强肠黏膜屏障和调节肠道动力,起到改善脾肾阳虚证肠易激综合征临床症状的作用。2.当归生姜羊肉汤能够纠正脾肾阳虚IBS-D模型大鼠生理生化指标模型大鼠与正常组大鼠比较白细胞和血小板显著升高,差异具有显著性(P<0.05),灌胃当归生姜羊肉汤后白细胞和血小板和正常组相比无显著性差异,可见当归生姜羊肉汤能使白细胞和血小板恢复正常。模型大鼠胆红素和甘油三酯明显降低,尿素氮和肌酐明显高于正常组且有显著性差异(P<0.05),结合尿常规结果,脾肾阳虚组的尿液明显酸化改变,服用当归生姜羊肉汤后尿液PH值、尿蛋白、生化指标趋于正常。喂食当归生姜羊肉汤30 d的雌性大鼠肝、脾、肺、肾、大脑、卵巢、肾上腺的BDI值均>1,显示当归生姜羊肉汤给药后有助于各脏器系数的恢复,而雌性大鼠的胸腺BDI值Medical laboratory均<1,提示腺嘌呤和番泻叶水造成雌性大鼠胸腺的功能抑制,且当归生姜羊肉汤无明显改善作用。但雌性大鼠各脏器总累计GS值均>10。3.给药当归生姜羊肉汤可改善脾肾阳虚IBS-D模型大鼠临床症状与模型鼠相比,当归生姜羊肉汤低、中、高3个剂量组大鼠的精神状态、耳尾颜色、毛发、粪便均有所改善,有显著性差异(P<0.05)。通过旷场实验发现,当归生姜羊肉汤低、中、高三个剂量组在中心区域和周边区域的时间、距离、快速移动时间、慢速移动时间与模型组比较都有明显提高。从RGB值数据来看,当归生姜羊肉汤可改善ISB-D大鼠尾部、足底、舌面的色泽等中医证候表现。q PCR结果显示与当归生姜羊肉汤治疗应急性肠炎相关基因IL-6、IL-1β、TNF-α的表达水平与正常组比显著增加(P<0.05),而IFN-γ表达则显著下降(P<0.05),灌服当归生姜羊肉汤后IL-6、IL-1β、TNF-α表达趋于正常,与模型鼠组比差异显著(P<0.05),IFN-γ表达则显著回升。4.当归生姜羊肉汤可调节脾肾阳虚IBS-D模型大鼠肠道菌群丰度和菌群结构,缓解炎症性症状。通过调节血清c AMP、T_3水平,经AGE-RAGE、MAPK、IL-17、Ca M信号通路等通路影响能量代谢实验观察到模型大鼠的体温和活动度下降,喂食当归生姜羊肉汤后体温恢复,活动度也增加,血清c AMP、T_3水平随给药剂量增加而升高,这两项对体温调节有重要作用;肠道菌群丰度方面,脾肾阳虚组厚壁菌门拟杆菌门显著下降,而厚壁菌门是一类可产生高量短链脂肪酸的菌群,拟杆菌门菌群内的某些成员可以帮助消化纤维素和其他难以消化的多糖,从而提供能量,所以脾肾阳虚模型动物肛温下降,而在喂食当归生姜羊肉汤后,产生高量短链脂肪酸的菌群增加至81.6%-84.6%水平,因而体温恢复正常;不同的肠道微生物群落对宿主免疫系统的调节产生不同的影响,而这种相互作用可能在保持肠道免疫平衡在防止炎症性肠病的发生发展过程中发挥着重要的作用Canagliflozin体内,通过改善肠道菌群结构,可以有效缓解炎症性肠病的症状。另一方面与正常组比较,脾肾阳虚证IBS-D模型大鼠能量代谢相关基因calsyntenin3β,DIO2,S100B,瘦素显著下调(P<0.05),在灌服当归生姜羊肉汤后三个基因明selleck Erastin显上调,且与模型大鼠相比差异显著(P<0.05)。模型组解偶联蛋白表达水平与正常组动物相比显著上升,但在灌服当归生姜羊肉汤后三个基因明显上调,且与模型大鼠相比差异显著(P<0.05),与正常组比较差异不显著,进一步影响了能量代谢水平从而提高体温。结论:网络药理学研究结果提示当归生姜羊肉汤可经AGE-RAGE信号通路、c AMP信号通路、MAPK信号通路、IL-17信号通路、Ca M信号通路等通路,增强肠黏膜屏障和调节肠道动力,起到改善脾肾阳虚证IBS-D临床症状的作用。以腺嘌呤和冰番泻叶水灌胃可以成功制作脾肾阳虚证IBS-D模型。灌服当归生姜羊肉汤后能够纠正模型大鼠的生理生化指标,改善模型大鼠的中医望诊表现。经肠道菌群及能量代谢研究,当归生姜羊肉汤能够调节能量代谢相关的拟杆菌门和厚壁菌门的菌群,使其恢复并增加至81.6%-84.6%水平,促进体温恢复,通过改善肠道菌群结构,影响炎症因子基因的表达,使得肠道恢复健康。与此同时检测发现当归生姜羊肉汤显著影响了能量代谢相关基因calsyntenin3β,DIO2,S100B,进一步促进了模型鼠体温的恢复。