目的:针对苦参现代多为生用,而传统多制用的用药差异,在前期研究基础上,对从古籍中有记载的苦参8种炮制品中筛选出的麸炒苦参、米泔制苦参进行进一步深入研究。通过考察苦参炮制前后化学成分变化、苦参炮制前后对湿热型溃疡性结肠炎(UC)小鼠的作用及其作用机制以及苦参炮制前后对湿热型UC小鼠肠道菌群的影响,解析苦参的炮制原理,为苦参炮制品临床应用提供依据。对优选出的米泔制苦参炮制工艺进行优化,建立生苦参、米泔制苦参质量标准,为米泔制苦参的炮制工艺、质量标准研究及临床合理应用提供理论基础。材料与方法:材料:苦参购自四川新荷花中药饮片股份有限公司,经辽宁中医药大学尹海波教授鉴定为为豆科植物苦参Sophora flavescens Ait.的干燥根;Waters Acquity ~(TM)I-class超高效液相色谱仪,配有Masslynx4.1质谱工作站(美国Waters公司);Waters e2695高效液相色谱仪;Multiskan MK3酶标仪;TLR4、My D88、NF-κBp65抗体购自Cell Signaling生物科技有限公司;C57BL/6小鼠,购自辽宁长生生物科技有限公司。方法:1.基于UPLC-Q-TOF-MS~E分析的苦参炮制前后化学成分差异采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS~E),在正、负离子模式下,结合苦参总化学成分数据库及UNIFI信息平台中内置化学成分数据库结合作为筛选数据库,对生苦参、麸炒苦参、米泔制苦参的化学成分进行定性分析。同时,利用SIMCA-P软件,采用多元统计分析方acute pain medicine法,通过主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA),寻找生苦参与麸炒苦参,生苦参与米泔制苦参间化学成分差异标志物。2.苦参及其炮制品对湿热型UC小鼠作用及对TLR4/My D88/NF-κB通路的调节作用将SPF级C57BL/6小鼠随机分为8组,分别为空白组、模型组、阳性组、生苦参组、麸炒苦参组、米泔制苦参组、麦麸辅料组、米泔水辅料组,每组6只。通过自由饮用3%葡聚糖硫酸钠(DSS)蒸馏水,配合高糖高脂饮食蜂蜜水和持续高温高湿环境,建立湿热型UC小鼠模型。造模同时给予灌胃给药,连续10 d,进行一般疾病活动指数(DAI)评分,第11 d处死小鼠,取GNE-140体内实验剂量结肠并测AZD2281量长度,酶联免疫法检测小鼠血清中巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-10(IL-10)以及结肠组织中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平,HE染色观察病理切片,PCR和Western Blot法检测TLR4、My D88、NF-κBp65 m RNA及蛋白表达。3.苦参及其炮制品对湿热型UC小鼠肠道菌群的影响通过自由饮用3%葡聚糖硫酸钠(DSS)蒸馏水,配合高糖高脂饮食蜂蜜水和持续高温高湿环境,建立湿热型UC小鼠模型。造模同时给予灌胃给药,连续10 d,末次灌胃给药后,采集空白组、模型组、阳性组、生苦参组、麸炒苦参组、米泔制苦参组小鼠粪便,保存至无菌EP管,迅速放入液氮中,-80℃保存。每组6个样本进行肠道菌群多样性检测,采用Illumina Mi Seq测序平台,运用荧光定量分析法对16S r RNA V3-V4区有效序列进行Mi Seq的2×468bp双端测序。4.米泔制苦参炮制工艺优化根据《雷公炮炙论》中对米泔制苦参的炮制工艺记载,以蒸制时间、浸泡时间、米泔水浓度为考察因素,以米泔制苦参的3种增量黄酮类成分三叶豆紫檀苷、异黄腐醇、槐属二氢黄酮G为考察指标,采用正交设计法,优化米泔制苦参的最佳炮制工艺。5.生苦参、米泔制苦参质量标准研究在最佳米泔制苦参炮制工艺优化基础上,以米泔制苦参中的增量成分三叶豆紫檀苷、槐属二氢黄酮G作为生苦参、米泔制苦参的薄层鉴别及含量测定的检测指标,检查生苦参、米泔制苦参中的水分、灰分,并对生苦参、米泔制苦参的浸出物、性状鉴别、显微鉴别进行系统研究,建立生苦参、米泔制苦参质量标准。结果:1.基于UPLC-Q-TOF-MS~E分析苦参炮制前后化学成分差异正离子模式下鉴定化合物75个,以黄酮类、生物碱类成分为主,其中黄酮类成分50种,生物碱类成分16种,三萜类成分4种,二苯甲基衍生物3种,糖苷类成分1种,蒽醌类成分1种;负离子模式下鉴定化合物44个,以黄酮类成分为主,其中黄酮类成分41种,生物碱类成分1种,二苯甲基衍生物1种,糖苷类成分1种;生苦参与麸炒苦参比较,在正、负离子模式下共鉴定了6种差异性成分,大部分为黄酮类化合物。生苦参与米泔制苦参比较,在正、负离子模式下分别鉴定了9种和1种差异性成分,大部分为黄酮类、三萜类化合物。2.苦参及其炮制品对湿热型UC小鼠作用及对TLR4/My D88/NF-κB通路的调节作用与空白组比较,湿热型UC模型小鼠DAI评分升高;结肠长度减少;结肠病变严重,有大量淋巴细胞浸润;血清中MIF、TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8含量升高,IL-10含量降低(P<0.01);结肠组织中MDA含量升高,SOD含量降低(P<0.01);结肠组织中TLR4、My D88,NF-κBp65 m RNA及蛋白表达明显升高(P<0.01)。与模型组比较,各给药组均能降低湿热型UC小鼠DAI评分;增加其结肠长度;减轻结肠病变严重程度及淋巴细胞浸润程度;降低湿热型UC小鼠血清中MIF、TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8含量,升高IL-10含量(P<0.01);降低结肠组织中MDA含量,升高SOD水平(P<0.01);降低结肠组织中TLR4、My D88,NF-κBp65 m RNA及蛋白表达(P<0.01);麦麸辅料和米泔水辅料组较模型组未见明显差异(P>0.05)。苦参及其炮制品具有治疗湿热型UC的作用,经麸炒或米泔制后效果更好。3.苦参及其炮制品对湿热型UC小鼠肠道菌群的影响Alpha多样性分析显示,与空白组比较,湿热型UC模型小鼠肠道菌群Shannon指数、Simpson指数显著降低(P<0.01);Beta多样性分析显示,空白组与模型组两者之间肠道菌群结构及多样性存在差异;在门分类水平上,湿热型UC模型小鼠厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)相对丰度均下降,变形菌门(Proteobacteria)相对丰度显著上升(P<0.01);在属分类水平上,湿热型UC模型小鼠乳杆菌属(Lactobacillus)、norank＿f＿＿Muribaculaceae属、螺杆菌属(Helicobacter)、拟杆菌属(Bacteroides)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、Prevotellaceae＿UCG-001属、Parabacteroides属、Odoribacter属、g＿＿Lachnospiraceae＿NK4A136＿group属、Candidatus＿Saccharimonas属、Prevotellaceae＿Ga6A1＿group属、杜氏乳杆菌属(Dubosiella)相对丰度明显降低(P<0.01),肠杆菌属(Enterobacter)、大肠杆菌-志贺氏菌属(Escherichia-Shigella)相对丰度明显升高(P<0.01);与模型组比较,各给药组Shannon、Simpson指数均显著提高(P<0.01);各给药组小鼠肠道菌群结构及多样性较接近空白组;各给药组能明显上调厚壁菌门、拟杆菌门丰度,下调变形杆菌门丰度(P<0.05,P<0.01);与生苦参组比较,麸炒苦参组上调厚壁菌门作用更显著(P<0.05),米泔制苦参组上调拟杆菌门作用更佳(P>0.05);生苦参、麸炒苦参、米泔制苦参给药组能明显上调乳杆菌属、norank＿f＿＿Muribaculaceae属、螺杆菌属、拟杆菌属、双歧杆菌属、Prevotellaceae＿UCG-001属、Parabacteroides属、Odoribacter属、g＿＿Lachnospiraceae＿NK4A136＿group属、Candidatus＿Saccharimonas属、Prevotellaceae＿Ga6A1＿group属、杜氏乳杆菌属相对丰度,明显下调肠杆菌属、大肠杆菌-志贺氏菌属相对丰度,且每种均具有显著性差异(P<0.05,P<0.01),麸炒苦参组出现了大量Prevotellaceae＿Ga6A1＿group属、杜氏乳杆菌属、双歧杆菌属,米泔制苦参组出现了大量的Prevotellaceae＿Ga6A1＿group属,相对于模型组及生苦参组有显著性差异(P<0.05,P<0.01)。4.米泔制苦参炮制工艺优化通过正交试验优选出的最优米泔制苦参炮制工艺为:取生苦参饮片,加入浓度为0.2%的米泔水浸泡6 h后取出,用清水淘洗2次,常压蒸制6 h,取出,晒干。(米泔水的制备:取过4号筛的米粉与水混匀,搅拌得混悬液,即得。每2 g米粉,用1000m L水,米泔水用量以没过苦参片为度)5.生苦参、米泔制苦参质量标准研究暂订生苦参、米泔制苦参的质量标准为:生苦参的显微鉴别同2020版药典(一部),与生苦参相比,米泔制苦参显微鉴别应无淀粉粒;在254 nm、365 nm紫外光下,生苦参、米泔制苦参供试品在三叶豆紫檀苷、槐属二氢黄酮G标准品相应的位置上,应显相同颜色的斑点;生苦参、米泔制苦参水分均不得过11.0%;生苦参、米泔制苦参总灰分均不得过8.0%;生苦参水溶性浸出物不得少于20.0%,米泔制苦参水溶性浸出物不得少于13.7%;生苦参含三叶豆紫檀苷的量不得少于0.09%,米泔制苦参含三叶豆紫檀苷的量不得少于0.14%,生苦参含槐属二氢黄酮G的量不得少于0.09%,米泔制苦参含槐属二氢黄酮G的量不得少于0.14%。结论:1.生苦参经麸炒、米泔制之后黄酮类化合物、三萜类化合物发生了改变,为生制品间的差异性成分。2.苦参及其炮制品均能抑制TLR4/My D88/NF-κB通路从而发挥治疗湿热型UC的作用,经麸炒或米泔制后效果更好。3.苦参及其炮制品均能调节湿热型UC小鼠肠道菌群结构,从而达到缓解肠道炎症反应的治疗作用,其中麸炒苦参、米泔制苦参的作用优于生苦参。4.采用正交试验获得米泔制苦参最佳炮制工艺,该方法稳定、可行。5.制订的以米泔制苦参中增量成分三叶豆紫檀苷、槐属二氢黄酮G作为含量测定指标的质量标准,可为米泔制苦参的炮制工艺评价和质量控制提供参考。