禽白血病(Avian leukosis,AL)是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)或逆转录病毒科肉瘤病毒引起的一种严重危害禽类健康的肿瘤性疾病。该病以免疫抑制、繁殖能力下降、多脏器出现肿瘤等为特征,是危害我Structuralization of medical report国禽类养殖中的重要传染病之一。目前,ALV的有效预防和控制措施主要是种源净化。许多欧洲和美国国家已经根除了ALV。但在中国,养殖规模复杂,品种繁多,所以根除是具有挑战性的,试图开发一种控制ALV的疫苗,效果也不尽如人意。近年来,许多学者开始关注抗病育种领域,捷克科学家首次通过使用CRISPR/Cas9靶向受体开发出抗ALV-J鸡,这可能有助于预防和控制ALV。但ALV亚型众多,不同亚型入侵宿主细胞的确认细节受体不同,病毒的不断重组变异导致新亚群新毒株的出现,靶向单一亚群病毒受体的抗病育种不能有效防控众www.selleck.cn/products/MK-1775多亚群ALV、变异株及内源性ALV的流行。因此,筛选ALV保守互作宿主因子为抗病育种提供靶点,可为禽白血病的净化带来新的研究视角。核仁素(nucleolin,NCL)是真核细胞中的一种具有多功能核仁蛋白质,有报道称核仁素是多种病毒、细菌和毒素的受体。经本实验室前期研究发现,NCL蛋白与ALV的U3区存在明显的互作关系,但NCL在ALV复制过程中的具体功能还需进一步分析。本研究首先扩增NCL基因,连接pc DNA3.1-EGFP-3×FLAG载体对NCL进行过表达,重组质粒命名为pc DNA3.1-NCL,同时设计2个特异性干扰RNA(si RNA)沉默NCL的表达。将pc DNA3.1-NCL转染至HEK-293T细胞,收获NCL蛋白,通过微量热泳动仪验证NCL与U3确实存在互作关系。随后将pc DNA3.1-NCL和si RNA分别转染至DF-1细胞后接种ALV,通过ELISA、RT-q PCR确定了NCL对ALV的复制起着抑制作用;同时通过双荧光素酶报告基因检测技术分析过表达或干扰表达NCL对ALV启动子和增强子的影响,确定NCL能够调控启动子和增强子的活性,进而抑制ALV的复制。有报道称野生型的p53蛋白与肿瘤发生密切相关,可以与ALV-J U3区在细胞核发生结合并抑制病毒复制,本试验通过免疫共沉淀确定了NCL与p53有相互作用,这可能是NCL参与病毒复制的另一方面。基于此,本研究应用CRISPR/Cas9技术对NCL基因进行编辑,共设计了3对sg RNA,将其退火粘合后与PX459载…