细Rapamycin纯度菌VΙ型分泌系统(Type VI secretion system,T6SS)作为纳米级跨膜的分泌系统,广泛存在于革兰氏阴性细菌中,通过将效应蛋白注射到细胞外,建立起细菌与细菌、细菌与环境、细菌与宿主之间的联系。假结核耶尔森氏菌YPⅢ一共有四套T6SS(T6SS-1～T6SS-4),前期研究表明T6SS-1能够在37℃下高表达,并且受到铁摄取调节蛋白(Ferric uptake regulator,Fur)的负调控,这暗示着T6SS-1可能参与环境中的营养摄取。然而,目前对于T6SS-1及其效应蛋白的具体功能和作用机制尚不明确。本研究以YPⅢ为研究对象,对T6SS-1及其效应蛋白Tce2的功能和作用机制进行深入探究。具体研究结果如下:1.首先利用分泌实验确定Tce2(YPK＿0405)是由T6SS-1的效应蛋白。以Fur负调控T6SS-1为切入点,通过q RT-PCR发现Tce2在Δfur中显著上调。随后利用等温滴定量热仪(ITC)技术、原子吸收检测和铁染色实验,证实Tce2是一个三价铁离子(Fe~(3+))结合蛋白。通过生长曲线实验和电RSL3临床试验感耦合等离子体质谱(ICP-MS)技术,确证Tce2参与Fe~(3+)转运。此外,利用限定培养基内进行的非接触依赖细菌间竞争实验,明确Tce2介导细菌之间的营养竞争。2.为了探究Tce2是否具有其它未知功能,利用网页版Clustal W和Espript分析,推测Tce2可能是一类热点重组蛋白(Rearrangement hotspot,Rhs)。体外纯化Tce2进行酶活实验,鉴定Tce2是一类非特异降解DNA的水解酶。进一步通过Tce2毒性检测、随机突变筛选和GST-pull down实验,证实Tce2对大肠杆菌具有毒性,Tci2(YPK＿0406)是Tce2的免疫蛋白,第17位谷氨酸是Tce2发挥DNA水解酶功能的关键活性位点。利用流式细胞术和激光共聚焦成像技术,证实Tce2能够水解大肠杆菌的基因组,从而造成细菌死亡。最后,细菌种内竞争实验证实Tce2可以同时介导YPⅢ进行接触依赖型和非接触依赖型的杀菌竞争。3.为了探究Tce2发挥离子转运和非接触依赖杀菌竞争的机制,我们利用GST-pull down筛选出作用于细菌细胞外膜上Tce2的受体Tds R(Ton B-dependent siderophore receptor),并利用细菌双杂交实验对其相互作用进行验证。ICP-MS实验明确了Tds R介导离子转运;通过外加Tce2毒性实验、细菌种内和种间的非接触依赖竞争实验和基于Tce2-GFP和Tce2-AF488标记YPⅢ三种菌株WT、Δtds R和Δtds R(tds R)的成像实验,证实Tds R介导假结核耶尔森氏菌通过非接触依赖的方式参与杀菌竞争。通过同源比对分析,发现大肠杆菌细胞外膜存在与Tds R同源的细胞外膜受体Tds R_(EC),并确证Tds R_(EC)可以介导Tce2进入大肠杆菌内。4.Tce2发挥离子转运功能和杀菌功能由同一受体介导,这暗示我们或许二者之间存在某种关联,为了探究这一猜想,我们在无铁和有铁的环境下,分别进行细菌间非接触依赖竞争实验、外加Tce2的毒性实验、GST-pull down和基于Tce2-AF488标记的细菌进入实验,确证Fe~(3+)促进Tce2与Tds R的相互作用,进而增加Tce2进入细菌细胞质内的效率。由此我们提出了一种新的细菌竞争模型:Tce2通过结合Fe~(3+)将自身伪装成“特洛伊木马”,诱骗其它细菌将其摄入细胞内,发挥DNase功能进而杀死竞争对手。5.为了探究上述模型在宿主的生理环境下是否同样适用,我们分别在抗生素预处理和无处理的条件下,检测小鼠盲肠内假结核耶尔森氏菌WT、Δtceplacenta infection2、Δclp V1的定殖情况,同时对盲肠内容物细菌进行16S r RNA测序分析,发现T6SS-1和Tce2通过作用于多种肠道原生土著细菌介导YPⅢ成功定殖。随后,通过检测假结核耶尔森氏菌与多种细菌(大肠杆菌、沙门氏菌、克雷伯氏菌、金黄色葡萄球菌和粪肠球菌)在小鼠盲肠内和环境中的竞争实验,证实Tce2介导的细菌间竞争具有广泛性。6.为了探究Tce2在肠道耐药致病细菌治疗方面的潜在价值,我们在枯草芽孢杆菌中异源表达Tce2,给提前感染高耐药的肠道致病菌(大肠杆菌、沙门氏菌、克雷伯氏菌)的小鼠,分别灌胃PBS缓冲液、表达空载体和Tce2的枯草芽孢杆菌,通过检测不同时间点肠道致病细菌的CFU,证实Tce2能够有效减少肠道致病细菌的定殖数目,这为治疗高耐药性细菌提供新思路。总结:本研究发现假结核耶尔森氏菌T6SS-1的效应蛋白Tce2是一个同时具有离子转运和毒性作用的双功能蛋白,能够以一种“特洛伊木马”的方式介导细菌种内和种间竞争,因其作用靶标具有广泛性,在治疗肠道耐药细菌感染中颇具潜力。