肾病综合征（Nephrotic Syndrome,NS）是常见的由肾小球疾病引起的一组临床综合证,其典型表现是大量蛋白尿、高度水肿、高脂血症和低白蛋白血症,即通常所说的“三高一低”。水肿的发生往往是患者发现身体不适的重要表现,同样被医生视为临床诊断的重要标准之一。水通道蛋白（Aquaporins,AQPs）是一类能够允许水分子通过的蛋白质,其主要功能是调节水分的吸收和排泄,维持细胞和组织内的水分平衡。AQP2特异性表达与肾脏组织中,主要分布于肾集合管主细胞质膜上,被认为是参与机体内水重吸收的关键蛋白。一般认为在肾脏中AQP2的表达主要受精氨酸加压素（Arginine vasopressin,AVP）2型受体（V2R）调控。此外,NS患者存在血管紧张素Ⅱ（Angiotensin,AngⅡ）等激素的表达异常,认为AngⅡ也能参与调节AQP2。AVP和AngⅡ的药理学活性主要受其受体V2R和AT1R调节,通过V2R和AT1R调控AQP2的机制仍不明确。当归芍药散（Danggui Shaoyao San,DSS）出自《金匮要略》,全方由当归、白芍、川芎、白术、茯苓、泽泻六味药组成,是经典的中医方剂之一,全方共奏养血调经,健脾利湿之功。DSS作为活血利水治法的代表方剂,在临床治疗NS中具有显著作用,但是DSS改善NS水肿的作用机制仍不明确。目的:本课题旨在通过研究AVP-V2R与AngⅡ-AT1R之间的交互作用进一步阐明NS水肿的发生机制,并以DSS含药血清干预,验证其通过调控V2R和AT1R的表达调节AQP2进而改善水肿的机制,以期为DSS临床应用提供基础。方法:第一章探究AVP-V2R与AngⅡ-AT1R之间的交互作用对AQP2的调节作用本实验以V2R和AT1R的受体抑制剂并利用慢病毒技术沉默相应受体,探讨AVP-V2R与AngⅡ-AT1R之间的交互作用。（一）在受体抑制剂应用方面体外培养小鼠M-1细胞,分为两个亚组:（1）正常组、dDAVP组、托伐普坦组、氯沙坦组,以验证AVP调节AQP2过程中V2R和AT1R的作用;（2）正常组、AngⅡ组、托伐普坦组、氯沙坦组,以验证AngⅡ调节AQP2过程中V2R和AT1R的作用。CCK-8法结合Western blot筛选dDAVP、AngⅡ、托伐普坦、氯沙坦的最佳浓度。以ELISA试剂盒检测小鼠M-1细胞中cAMP、AQP2的含量。利用RT-qPCR检测细胞AT1RmRNA、VR2mRNA的表达;采用Western blot检selleck化学测细胞V2R、AT1R、AQP2、pS256-AQP2蛋白表达情况。应用IF观察细胞V2R、AT1R、AQP2、pS256-AQP2蛋白表达情况。（二）在慢病毒沉默V2R、AT1R应用方面体外培养小鼠M-1细胞,采用慢病毒转染技术,分别获得V2R沉默（shV2R）、AT1R沉默（shAT1R）的细胞。分为两个亚组:（1）正常组、空载组、shV2R组、shAT1R组、正常+dDAVP组、dDAVP+shV2R组、dDAVP+shAT1R组;（2）正常组、空载组、shV2R组、shAT1R组、正常+AngⅡ组、AngⅡ+shV2R组、AngⅡ+shAT1R组,以验证AVP、AngⅡ干预下V2R和AT1R在调节AQP2的作用差异。应用ELISA检测细胞中cAMP、AQP2的含量;采用RT-qPCR和Western blot技术检测mRNA和各蛋白表达情况。第二章当归芍药散对dDAVP和AngⅡ干预M-1细胞的AQP2表达机制的影响制备DSS含药血清。体外培养小鼠肾集合管M-1细胞,分为两个亚组:（1）正常组、dDAVP组、托伐普坦组、氯沙坦组、5%DSS含药血清组、10%DSS含药血清组、15%DSS含药血清组,考察DSS通过影响AT1R、V2R介导AVP-AQP2作用途径;（2）正常组、AngⅡ组、托伐普坦组、氯沙坦组、5%DSS含药血清组、10%DSS含药血清组、15%DSS含药血清组,考察DSS通过影响AT1R、V2R介导AngⅡ-AQP2作用途径。应用ELISA检测细胞中cAMP、AQP2的含量;采用RT-qPCR、Western blot和IF技术检测mRNA和各蛋白表达情况。结果:第一章探究AVP-V2R与AngⅡ-AT1R之间的交互作用对AQP2的共同调节作用1、CCK-8结合Western blot筛选到dDAVP、AngⅡ、托伐普坦、氯沙坦的最适浓度分别为:10-7M、10-8M、10-6M、10-8M。2、ELISA结果显示:（1）经dDAVP、AngⅡ刺激后细胞内cAMP、AQP2表达均显著增加（p<0.05,p<0.001）;（2）托伐普坦和氯沙坦均可以降Regorafenib分子量低细胞内AQP2的含量（p<0.05,p<0.01）;（3）与dDAVP刺激组相比,托伐普坦可以降低cAMP的含量（p<0.05）;与AngⅡ组相比,氯沙坦可以降低cAMP的含量（p<0.01）;但dDAVP刺激后给予氯沙坦和AngⅡ刺激后给予托伐普坦对细胞cAMP含量均无显著差异;（4）与正常组相比,沉默V2R（shV2R）组cAMP含量显著降低（p<0.001）,沉默AT1R（shAT1R）组cAMP的表达与正常组无差异;（5）与正常组相比,沉默V2R和AT1R后,细胞中AQP2的含量显著减少（p<0.001）;（6）shV2R、shAT1R组分别经dDAVP、AngⅡ刺激后,cAMP含量显著减少（p<0.01）,其中V2R沉默后减少更显著（p<0.0001）;（7）经dDAVP、AngⅡ刺激后,shV2R、shAT1R组AQP2含量相较正常组被刺激后显著减少（p<0.01,p<0.001）。3、RT-qPCR结果显示:（1）经dDAVP、AngⅡ刺激后细胞内AT1RmRNA、VR2mRNA的表达显著增加（p<0.001）;（2）托伐普坦和氯沙坦干预后细胞内AT1RmRNA、VR2mRNA的表达较dDAVP、AngⅡ组显著降低（p<0.01,p<0.001）;（3）与正常组相比,沉默V2R后细胞内VR2mRNA表达显著降低（p<0.001）,AT1RmRNA表达无显著变化;沉默AT1R后细胞内AT1RmRNA表达显著降低（p<0.001）,VR2mRNA表达无显著变化;（4）经dDAVP、AngⅡ刺激后,shV2R组细胞内V2RmRNA表达显著减少（p<0.001）,但是不能阻止AT1RmRNA的表达显著增加（p<0.001）;shAT1R组细胞内AT1RmRNA的表达显著减少（p<0.001）,但是不能阻止VR2mRNA表达显著增加（p<0.001）。4、Western blot结果显示:（1）在dDAVP、AngⅡ刺激后,各组细胞内V2R、AT1R、AQP2、p-S256AQP2的表达均显著增加（p<0.05或p<0.01或p<0.001）;（2）托伐普坦和氯沙坦均能显著降低细胞内V2R、AT1R、AQP2、p-S256AQP2的表达（p<0.05或p<0.01或p<0.001）;（3）与正常组相比,沉默V2R（shV2R）组细胞内V2R表达显著降低（p<0.05）,AT1R表达无差异;沉默AT1R（shAT1R）组细胞内AT1R表达显著降低（p<0.01）,V2R表达无差异;（4）沉默V2R和AT1R后,再经dDAVP、AngⅡ刺激,细胞内AQP2与p-S256AQP2的表达增加（p<0.01,p<0.001）,但是低于正常组;shV2R组与shAT1R组对应受体蛋白的表达仅比未刺激前增加,仍低于正常组。5、IF结果显示,经dDAVP、AngⅡ刺激后,细胞内V2R、AT1R、AQP2、p-S256AQP2的表达均增加,在托伐普坦、氯沙坦干预后,细胞内V2R、AT1R、AQP2、p-S256AQP2的表达均降低。第二章当归芍药散对dDAVP和AngⅡ干预M-1细胞的AQP2表达机制的影响1、ELISA结果显示:（1）经dDAVP、AngⅡ刺激后细胞内cAMP、AQP2表达均显著增加（p<0.05）,在托伐普坦、氯沙坦、不同浓度的DSS含药血清干预后,细胞内AQP2的含量降低;（2）在dDAVP刺激后,除氯沙坦组外,其他组cAMP含量均显著降低,15%DSS含药血清降低细胞内cAMP含量最显著（p<0hepatobiliary cancer.001）,10%DSS含药血清降低细胞AQP2含量最显著（p<0.01）;（3）在AngⅡ刺激后,除托伐普坦组外,其他组cAMP含量均显著降低,10%DSS含药血清降低细胞内cAMP、AQP2的含量最显著（p<0.001）。2、RT-qPCR结果显示:（1）经dDAVP、AngⅡ刺激后细胞内AT1RmRNA、VR2mRNA的表达显著增加（p<0.05）,在托伐普坦、氯沙坦及不同浓度的DSS含药血清干预后,细胞内AT1RmRNA、V2RmRNA的表达显著均降低（p<0.05或p<0.01或p<0.001）;（2）在dDAVP刺激后,10%DSS含药血清降低细胞内AT1RmRNA的表达最显著（p<0.001）,15%DSS含药血清降低细胞内VR2mRNA的表达最显著（p<0.001）;在AngⅡ刺激后,氯沙坦降低细胞内AT1RmRNA的表达最显著（p<0.001）,10%DSS含药血清降低细胞内VR2mRNA最显著的表达（p<0.001）。3、Western blot结果显示:（1）经dDAVP、AngⅡ刺激后,细胞内V2R、AT1R、AQP2、pS256-AQP2均显著性增加（p<0.01,p<0.001）。在托伐普坦、氯沙坦及不同浓度的DSS含药血清干预后,细胞内V2R、AT1R、AQP2、pS256-AQP2均显著性降低（p<0.05或p<0.01或p<0.001）;（2）在dDAVP刺激后,氯沙坦降低V2R和AT1R的表达最为显著（p<0.01）,5%DSS含药血清降低AQP2的表达最为显著（p<0.001）,15%DSS含药血清降低p-S256AQP2的表达最显著（p<0.001）;在AngⅡ刺激后,10%DSS含药血清组降低V2R的表达最为显著（p<0.01）,15%DSS含药血清组降低AT1R、AQP2和p-S256AQP2的表达最为显著（p<0.01）。4、IF结果显示,经dDAVP、AngⅡ刺激后,细胞内V2R、AT1R、AQP2、pS256-AQP2表达均增加,在托伐普坦、氯沙坦和不同浓度DSS含药血清干预后,细胞内V2R、AT1R、AQP2、pS256-AQP2表达均降低。结论:1、AVP-V2R与AngⅡ-AT1R信号通路通过交互作用协同上调AQP2表达,共同介导NS水肿的发生。2、当归芍药散含药血清通过综合调节V2R和AT1R表达抑制AQP2作用。