肾脏作为维持人体生命和正常功能所必需的重要器官,同时也是人体最容易老化的器官之一。肾脏在衰老过程中会发生一系列结构病变,异常的纤维形成将损害肾脏结构和功能的平衡,导致终末期肾脏疾病的发生,最终导致肾功能衰竭而危害健康。然而,衰老相关肾损害的确切机制仍不清楚。氧化应激和炎症在衰老相关疾病的病因学中起着关键作用。APP/PS1小鼠是常用的多基因转基因小鼠模型,用于研究阿尔兹海默症和相关神经退行性疾病的发病机制。因APP/PS1转基因小鼠多用于老龄化相关神经退行性疾病的研究,且相关研究通道多与钙离子通道相关;结合本课题组前期有关该类小鼠与NLRP3通路之间关联的研究,因此本课题拟以APP/PS1小鼠与NLRP3信号通路为切入点,深入研究NLRP3炎性小体对增龄性肾脏损害的作用及分子机制。人参皂苷Rg1(Ginsenoside 1,Rg1)是一种重要的抗衰老活性成分,已被证实对氧化应激、炎症反应、自噬反应等多种途径有一定程度的调控作用,同时前期实验也证实Rg1对于普通老龄化小鼠相关肾损伤有改良效果。本项目拟以老龄APP/PS1小鼠为对象,探讨NLRP3信号途径对老年性肾衰纤维化的影响机制及人参皂苷Rg1对其的调控作用。目的本研究旨在研究NLRP3信号通路在APP/PS1小鼠肾脏老化纤维化损伤的作用,并研究药物人参皂苷Rg1对于APP/PS1小鼠肾脏老化纤维化损伤改善作用的机制。方法选用6个月龄的APP/PS1雄性小鼠及野生型(WT)小鼠共48只,随机分为6组(n=8):分别为WT-9M对照组、APP/PS1-6M模型组、APP/PS1-9M模型组、APP/PS1-9M+Apocynin(50 mg/kg)组、APP/PS1-9M+Rg1(5 mg/kg)组、APP/PS1-9M+Rg1(10 mg/kg)组。其中WT-9M组为对照组,APP/PS1-6M组为治疗前对照组,APP/PS1-9M+Apocynin(50 mg/kg)组为阳性药物对照组,APP/PS1-9M+Rg1(5 mg/kg)组及APP/PS1-9M+Rg1(10 mg/kg)组为药物对照组。APP/PS1-9M+Apocynin(50 mg/kg)、APP/PS1-9M+Rg1(5 mg/kg)及APP/PS1-9M+Rg1(10 mg/kg)三组给予新鲜配制好的定量浓度药物,给药时间段为六月龄至九月龄,共12周;给药剂量0.1毫升/10克体重。WT-9M对照组及APP/PS1-9M模型组小鼠在与给药组小鼠给药同时给予新鲜配制好的等量溶剂0.5%CMC-Na溶液,给药时间段为六月龄至九月龄,共12周;给药剂量0.1毫升每10克体重。六组小鼠仍按正常生长方式饲养,观测造模期间各项指标及状态变化。12周造模结束后,断水断粮24小时后处死小鼠,采集各组小鼠血清及肾脏组织,分组编号保存妥当后用于后期各项实验指标检测。用BUN、Scr测定小鼠的肾脏功能;采用老化有关的β-半乳糖苷酶法测定肾脏的老化程度;用HE、油红O染色观察肾脏的病理改变;用免疫共沉淀法(IHC)观察小鼠肾脏中获悉更多的胶原蛋白纤维改变;Western Blot检测小鼠肾脏组织肾脏纤维化及衰老蛋白TGF-β和β-Gal的表达情况;IHC(KIM-1)染色检测小鼠肾脏组织KIM-1的表达情况;Western Blot检测小鼠肾组织炎症反应相关蛋白NLRP3,Caspase-1,IL-1β的表达情况;IHC(NLRP3)染色检测小鼠肾组织NLRP3的定位表达;Western Blot检测小鼠肾组织钙离子通道相关蛋白p-PLC,PLC,CN,NFAT2的表达情况。结果血清指数的测定表明:给药后,小鼠血浆尿素氮、肌酐含量显著低于模型组。β-半乳糖苷酶法结果表明:Apocynin、Rg1(5,10 mg/kg)可降低肾脏中β-半乳糖苷酶的表达。HE及油红O染色结果表明Apocynin、Rg1(5、10 mg/kg)能显著减轻APP/PS1-9M组肾脏衰老造成的肾损害,减轻肾组织脂肪沉积,对肾衰老进程有一定的抑制作用。免疫组化染色发现,给药组较模型组显著减少了衰老小鼠肾脏的胶原蛋白沉积。IHC(KIM-1)染色显示,Apocynin、Rg1(5,10 mg/kg)组较模型组显著减少KIM-1的表达;Western Blot结果显示,与模型组比较,Apocynin和Rg1(5,10 mg/kg)组处理显著降低了肾组织TGF-βprogrammed necrosis和β-Gal的表达,同时人参皂苷Rg1呈现一定程度剂量依赖性。Western Blot结果显示:与模型组比较,Rg1(10 mg/kg)处理显著降低APP/PS1小鼠肾组织NLRP3及caspase-1的表达,Rg1(5mg/kg)处理组相对于模型组对APP/PS1小鼠的caspase-1的降低效果明显,对于NLRP3的降低效果不明显;IHC(NLRP3)染色结果显示,Rg1(5,10 mg/kg)可显著下调APP/PS1小鼠肾小球和肾小管NLRP3的表达;Western Blot结果显示,Apocynin和Rg1(5,10 mg/kg)组能降低确认细节p-PLC,PLC,CN,NFAT2的表达,同时以Rg1(10mg/kg)剂量的降低效果最为明显。结论研究发现,与WT-9M及APP/PS1-6M相比,APP/PS1-9M模型小鼠模型存在显著的老化相关肾脏损害及纤维化。肾脏老化可引起NLRP3炎性小体活化。NLRP3在衰老肾脏中表达升高,并与肾脏纤维化及肾脏损伤密切相关。因此,NLRP3炎性小体可能成为防治增龄性肾脏损伤的新靶点。人参皂苷Rg1能显著改善老年肾小管上皮细胞的功能。Rg1可显著抑制KIM-1和NLRP3在肾脏中的表达。Rg1可通过PLC-CN-NFAT2途径抑制肾脏NLRP3炎性小体活化,从而改善肾脏老化所致的肾脏损伤及纤维化。