背景我国肺癌的发病率呈逐年递增趋势,是临床常见的恶性肿瘤。代谢重编程是癌症标志之一,包括糖代谢、脂代谢、以及氨基酸代谢的改变。癌症中葡萄糖代谢的变化主要体现为升高的有氧糖酵解,即Warburg效应,特征为葡萄糖摄取增强,糖酵解活跃,代谢产物乳酸含量增多。Warburg效应为癌细胞的快速增殖提供了大量能量,并且为生物大分子合成提供原料,促进了癌细胞生长。己糖激酶HK1作为糖酵解第一步的限速酶,在肺腺癌中呈高表达,主要通过与线粒体外膜结合启动糖酵解途径。端粒酶主要负责维持细胞中的端粒长度,在正常分化的体细胞中,端粒酶主要组分端粒酶逆转录酶(TERT)的基因转录被抑制,导致端粒酶活性被抑制,细胞中端粒随分裂而不断缩短,当缩短到一定限度时,细胞出现复制性衰老,进而死亡。而在大多数癌细胞中,端粒酶的异常激活可以延长癌细胞中的端粒长度,使癌细胞可以突破复制衰老的限制而无限增殖。TERT在细胞质中合成,并与分子伴侣HSP90和p23结合,通过核质穿梭进入细胞核中,从而参与端粒酶的组装和活性调节。有氧糖酵解为癌细胞生长提供大量ATP,促进了癌症发展。前期结果发现,肺腺癌细胞系A549中糖酵解影响端粒酶活性,而糖酵解如何改变端粒酶活性及其具体的分子机制尚不明确。目的本研究旨在探究肺腺癌细胞中糖酵解代谢调控端粒酶活性和端粒长度的机制,为临床肺腺癌的治疗提供新的方向。方法1.在A549细胞中加入糖酵解抑制剂2DG,通过RT-q PCR和western blot实验检测TERT的m RNA和蛋白水平的改变,通过端粒重复序列扩增方法(TRAP)对端BYL719浓度粒酶活性进行检测,端粒末端限制性片段分析方法(TRF)检测端粒长度。2.通过质谱分析,鉴定出与TERT互相结合的糖酵解关键酶HK1并通过细胞免疫共沉淀(COIP)进行验证。利用sh RNA技术敲低A549细胞中的HK1后,RT-q PCR实验和western blot实验检测TERT的m RNA和蛋白水平的改变。TRAP和TRF实验检测HK1被敲低后,端粒酶活性和端粒长度的改变。Q-FISH检测染色体末端的端粒信号强度。3.通过细胞浆细胞核蛋白分离实验检测敲低HK1后,胞质和胞核中TERT蛋白的表达情况。细胞衰老染色实验(SA-β-Gal)检测了细胞的衰Cryogel bioreactor老水平。结果1.糖酵解抑制剂2DG导致肺腺癌A549细胞中的端粒酶活性升高,端粒延长,而对TERT的m RNNVP-TNKS656配制A和蛋白表达无影响。2.己糖激酶HK1与TERT结合,改变TERT胞内定位,抑制TERT入核,降低A549细胞中端粒酶活性,缩短端粒长度,但不影响TERT的m RNA和蛋白表达。3.敲低HK1促进A549细胞衰老,联用端粒酶抑制剂BIBR1532后细胞衰老程度增加。结论1.己糖激酶HK1通过与TERT结合,改变TERT胞内定位,抑制TERT入核,从而下调A549细胞中端粒酶活性和端粒长度。2.敲低HK1促进A549细胞衰老和凋亡,联用端粒酶抑制剂BIBR1532后细胞衰老和凋亡程度增加。