研究背景阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种常见的以进行性认知和行为障碍为特征的神经退行性疾病。目前AD的发病机制尚不明确,目前广为接受的假说认为,β淀粉样蛋白(amyloid-β,Aβ)的生成和清除失衡是神经元变性和痴呆发生的起始因素,异常水平的Aβ在大脑神经元之间形成具有神经毒性的斑块,导致神经元变性、死亡。线粒体功能障碍在AD的发生和发展中起着重要作用。AD患者线粒体出现功能障碍,如线粒体生物合成降低,线粒体动力学异常、线粒体自噬功能障碍等。线粒体虽然有自己的DNA,但线粒体所需要的蛋白质大多由核基因编码,在细胞质核糖体中以线粒体靶向信号的前体蛋白形式合成,经线粒体转位酶(Translocase of the Outer Membrane,TOM)复合体识别并转运至线粒体发挥相应的生理功能。TOM70是TOM复合体的重要组成部分,是TOM复合体的主要受体蛋白之一,具有识别前体蛋白的功能。TOM70不仅作为线粒体前体蛋白的识别受体参与线粒体,而且还是线粒体蛋白导入障碍反应(mitoCPR)的关键调控蛋白。最近研究发现,TOM70在ANSC 125973生产商D患者脑组织中出现表达改变。但TOM70参与AD发病及相关机制并不明确。研究目的1.明确TOM70在AD中表达改变是否具有特异性;2.明确TOM70调节异常是否与病理性Aβ有关;3.探究TOM70是否可作为潜在性的AD诊断生物标志物;4.探究TOM70在AD中调节异常对线粒体生物功能的影响。研究方法1.检测TOM70在AD中表达水平变化情况1.1人外周血样本取得确诊AD,路易体痴呆(Lewy bodies,DLB),和卒中后痴呆(post-stroke dementia,PSD)的患者及年龄和性别匹配的认知功能正常的对照组的外周血,采用RForensic pathologyT-qPCR测定外周血TOM70 mRNA表达改变。通过神经心理学量表,包括蒙特利尔认知评估量表(Montreal Cognitive Assessment,MoCA),简易精神状态检查表(Minimum Mental State Examination,MMSE),临床痴呆评定量表(Clinical Dementia Rating,CDR)及内侧颞叶萎缩量表LEE011半抑制浓度(media temporal lobe atrophy scale,MTA),对入组人员进行疾病进展状况评估。对TOM70表达与性别、年龄及各种量表进行相关分析。1.2动物实验选取雄性APP/PS1双转基因小鼠(转染淀粉样前体蛋白和早老素1)作为AD动物模型,同性别月龄的C57BL/6J小鼠作为对照组,取得发病不同阶段(3、6、12月龄)的小鼠海马、皮层、小脑、骨骼肌、肝脏及外周血,测定TOM70 mRNA和蛋白表达情况。1.3细胞实验选取加入外源性Aβ_(25-35)的小鼠海马神经元细胞(HT22细胞)作为AD细胞模型测定TOM70 mRNA和蛋白表达情况。加入Aβ_(25-35)抑制剂,观察TOM70表达改变。2.研究TOM70表达异常对线粒体形态及功能的影响2.1体内实验选取7月龄C57及APP/PS1小鼠分为4组,分别为C57组小鼠、APP/PS1组小鼠、APP/PS1注射腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)空病毒组小鼠、APP/PS1注射AAV过表达TOM70组小鼠。小鼠立体定位后,双侧海马注射AAV空病毒或转染TOM70的AAV病毒,4周后进行后续实验。注射转染TOM70的AAV病毒可使小鼠海马组织过表达TOM70。使用Morris水迷宫实验检测小鼠记忆能力和空间学习。透射电镜检测小鼠神经元内线粒体形态;使用试剂盒检测海马组织中ATP含量、线粒体呼吸链功能;使用MitoSOX测定神经元线粒体活性氧水平,使用ELISA试剂盒测定小鼠海马Aβ_(1-40)和Aβ_(1-42)水平,硫磺素染色检测老年斑水平。2.2体外实验HT22细胞模型分为4组,分别为未干预组、Aβ_(25-35)干预组、Aβ_(25-35)干预并转染空载质粒组、Aβ_(25-35)干预并转染表达TOM70质粒组。转染TOM70质粒可使细胞过表达TOM70。使用ATP试剂盒检测细胞中ATP含量;使用MitoSOX检测细胞线粒体活性氧水平;使用TMRM检测线粒体膜电位水平;使用Seahorse线粒体压力测试检测线粒体呼吸功能。按照上述体内实验进行动物模型分组,实验结果1.TOM70在AD患者外周血中表达降低。与对照组相比,AD患者的TOM70 mRNA水平明显降低。然而,我们没有发现DLB组PSD组和匹配对照组之间有显著差异。受试者特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)分析显示,,在 AD 中,外周血中TOM70水平的ROC曲线下面积(Area Under Curve,AUC)显著提高,远远超过0.5。但DLB组和PSD组外周血中TOM70水平的AUC不显著。这说明外周血TOM70在AD患者中具有很好的特异性和敏感性。2.TOM70的降低与AD的进展相关。我们进一步分析了 TOM70水平在AD患者中的表达与临床特征的相关性。研究发现,TOM70水平与性别无相关性。TOM70水平与年龄呈负相关。TOM70 mRNA水平与MTA评分、CDR评分呈负相关,与MMSE评分、MoCA评分呈正相关。MMSE和MoCA评分与AD进展呈负相关,CDR和MTA评分与AD进展呈正相关。我们的数据表明,外周血中TOM70表达的降低与AD的病情进展相关。3.TOM70在AD中表达降低有组织特异性,与AD受累部位重叠。我们在3、6和12月龄APP/PS1小鼠的外周血、大脑(包括海马、皮层和小脑)、肝脏和骨骼肌中检测了TOM70mRNA和蛋白的表达水平,在6月龄和12月龄时,APP/PS1小鼠海马和外周血TOM70水平显著降低,并与年龄相关。然而,APP/PS1小鼠皮层、小脑、骨骼肌、肝脏中的TOM70水平并未降低。4.过表达TOM70可挽救线粒体功能。体内实验发现,在APP/PS1小鼠中,线粒体结构损伤,出现了线粒体嵴缺失、破裂,线粒体肿胀,呈空泡状。过表达TOM70后,线粒体形态有所改善。与APP/PS1小鼠相比,过表达TOM70后,小鼠海马组织ATP含量增加,线粒体呼吸链功能有所改善,线粒体活性氧水平降低。但是,过表达TOM70无法减少APP/PS1小鼠海马组织Aβ_(1-40)及Aβ_(1-42)水平,无法降低老年斑沉积。体外实验发现,与Aβ干预的HT22细胞相比,质粒转染TOM70的HT22细胞活性氧水平降低,线粒体膜电位水平增高,线粒体呼吸功能有所改善。5.过表达TOM70可减轻AD小鼠的空间学习和记忆能力受损症状。与C57小鼠相比,APP/PS1小鼠的潜伏期时间明显延长,过表达TOM70显著缩短了 APP/PS1小鼠的潜伏期。与C57小鼠相比,APP/PS1小鼠的穿越平台次数和在目的象限停留时间显著降低,过表达TOM70后,APP/PS1小鼠的穿越平台次数和目的象限停留时间增加。研究结论1.TOM70在AD中表达降低,且与AD受累部位重叠。2.TOM70表达降低与Aβ毒性密切相关。3.TOM70可作为潜在性的诊断AD,并判断疾病进展的生物标志物。4.AD中过表达TOM70可挽救线粒体功能。