研究背景:糖尿病肾病(diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病微血管损伤的并发症之一,是慢性肾脏病和终末期肾病的主要来源。肾小球损伤被认为是DKD进展的重要原因,但越来越多的研究证实肾小管间质损伤在DKD发生和发展中也发挥着重要作用。肾间质纤维化可发生于DKD早期,是导致肾功能不全主要且不可逆的因素。除了适当的血糖和血压控制,阻止或逆转肾纤维化的治疗方法非常有限。因此,探索DKD肾小管间质损伤和寻找有效干预措施,具有重要的临床意义。白介素37(interleukin-37,IL-37)是IL-1家族的第七个成员,是免疫反应和炎症的天然抑制剂。研究表明,IL-37抑制肾脏缺血再灌注损伤中肾小管上皮细胞炎症因子释放,提示IL-37对肾脏疾病有保护作用。此外,IL-37的表达与组织纤维化有关,例如鼻内给药IL-37改善博来霉素诱导的肺纤维化和炎症,同时IL-37转基因(IL-37 transgenic,IL-37tg)小鼠减轻自身免疫性肝病相关的肝纤维化和免疫细胞浸润。值得注意的是,IL-37tg小鼠改善高脂饮食诱导的肥胖和胰岛素抵抗。这些研究表明IL-37可能与DKD肾间质纤维化有关。然而,IL-37与DKD的关系尚未见报道。因此,本研究首先观察了IL-37在DKD患者肾组织中的表达情况,分析肾组织IL-37表达水平与肾间质纤维化程度和肾功能的相关性。随后,利用IL-37tg和野性型(wild type,WT)小鼠制备高脂饮食联合链脲佐菌素(streptozotocin plus high fat diet,STZ/HFD)诱导的DKD模型,观察IL-37过表达对DKD肾损伤和肾间质纤维化的影响。并通过IL-37tg和WT DKD模型小鼠测序结果分析IL-37影响DKD肾间质纤维化的可能机制。以体外培养的人近端肾小管上皮细胞(human proximal tubular cells,HK-2)为研究对象,阐明IL-37抑制高糖诱导HK-2细胞纤维化标志物高表达的内在机制。最后,利用IL-37tg和WT小鼠制备的DKD模型,体内验证IL-37抑制DKD肾间质纤维化的机制。方法和结果:第一部分:IL-37在DKD患者肾脏中的表达情况IL-37在DKD患者肾小管上皮细胞中的表达显著降低于陆军军医大学第二附属医院肾内科生物样本库中选取2018年1月-2019年12月肾癌患者远离癌组织的正常肾组织切片(n=10)作为对照组,肾穿刺活检病理诊断为DKD患者的肾组织切片(n=24)作为DKD组。记录DKD患者临床指标,包括血肌酐(serum creatinine,SCr)、24小时尿蛋白定量、估算的肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate,eGFR)。HE、PAS染色观察肾小球病理改变,Masson染色和IL-37免疫组织化学染色观察肾间质纤维化和IL-37表达水平。分析DKD患者肾组织IL-37表达水平与临床各指标的相关性。结果显示,与对照组相比,DKD患者组肾小球体积增大、系膜基质增多,同时出现明显的肾间质纤维化和肾小管上皮细胞IL-37表达显著降低,并且IL-37表达水平与肾间质纤维化程度、SCr、24小时尿蛋白定量呈显著负相关,与eGFR呈显著正相关。以上结果说明,肾小管上皮细胞IL-37的低表达与DKD肾间质纤维化及肾损伤程度有着密切的关联,IL-37可能参与了DKD的进展。第二部分:IL-37在DKD肾间质纤维化中的作用1.IL-37过表达减轻DKD肾损伤构建IL-37tg小鼠,Western blot和免疫组织化学染色观察IL-37表达情况。结果显示,WT组小鼠肾组织不表达IL-37;与WT组小鼠比较,IL-37tg组小鼠肾组织IL-37表达显著,说明IL-37tg小鼠构建成功。IL-37tg和WT小鼠通过STZ/HFD诱导小鼠DKD模型。每4周代谢笼收集各组小鼠24 h尿液、监测血糖。建模16周后取材,称量各组小鼠体重、肾重,ELISA检测尿白蛋白,酶法检测尿肌酐和SCr水平,实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测肾组织中肾损伤因子KIM1、NGAL mRNA表达水平。结果显示,与WT对照组小鼠相比,STZ/HFD诱导的小鼠出现血糖、SCr、尿蛋白/尿肌酐比值(urine albumin to creatinine ratio,UACR)显著升高,同时肾小球体积增大,系膜基质增多。以上结果提示STZ/HFD小鼠DKD模型造模成功。与WT DKD组CL 318952溶解度小鼠相比,IL-37过表达减轻DKD小鼠UACR、SCr升高,但并不影响血糖水平。与WT对照组小鼠相比,WT DKD组小鼠体重减轻、肾重/体重比值显著增加,KIM1、NGAL表达水平显著增加;而与WT DKD组小鼠相比,IL-37tg DKD组小鼠上述指标均明显减轻。以上结果说明,IL-37在DKD中发挥了重要的肾脏保护作用。2.IL-37过表达改善DKD肾间质纤维化Masson染色显示,与WT对照组小鼠相比,WT DKD组小鼠出现了明显的胶原沉积,提示出现了肾间质纤维化;而与WT DKD组小鼠相比,IL-37tg DKD组小鼠肾间质纤维化程度明显减轻。免疫组织化学染色和Western blot检测结果表明,与WT DKD组小鼠相比,IL-37tg DKD组小鼠肾纤维化标志物α-SMA、Fibronectin的表达显著降低。以上结果说明,IL-37过表达明显改善DKD肾间质纤维化。3.IL-37缓解高糖诱导的HK-2细胞纤维化标志物高表达在体外,HK-2细胞分别给予30 mmol/L高糖和/或300 ng/m L人IL-37重组蛋白(human recombinant IL-37,rec IL-37)孵育后,Western blot检测纤维化标志物α-SMA和Fibronectin表达水平。结果显示,30 mmol/L高糖孵育诱导HK-2细胞纤维化标志物高表达,而300 ng/m L rec IL-37共孵育抑制高糖诱导的HK-2细胞纤维化标志物表达升高。这说明,在体外,IL-37同样可以抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞纤维化标志物高表达。第三部分:IL-37改善DKD肾间质纤维化的机制1.IL-37tg与WT DKD小鼠测序分析提示脂肪酸代谢通路富集分离IL-37tg与WT DKD小鼠肾小管上皮细胞进行转录组测序。测序结果分析差异基因,分别进行GO、Reactom、KEGG通路富集,GSEA富集。结果herd immunity显示,WT与IL-37tg DKD小鼠部分基因表达差异明显,GO、Reactom、KEGG通路富集均提示脂肪酸代谢通路位于前列。GSEA进一步富集出脂肪酸β氧化(fatty acidβ-oxidation,FAO)。以上结果说明,IL-37可能通过调控肾小管上皮细胞FAO而改善肾间质纤维化。体外培养的HK-2细胞分别给予30 mmol/L高糖和/或300 ng/m L rec IL-37孵育后,测定各组细胞ATP含量,RT-qPCR检测FAO相关基因(MCAD、CROT、HADHB)的mRNA表达,油红O染色观察细胞脂滴沉积。结Cell Cycle抑制剂果显示,与对照组相比,高糖组HK-2细胞ATP水平和FAO相关基因mRNA表达显著降低、细胞内脂滴沉积,而300 ng/m L rec IL-37共孵育显著改善了上述指标。以上结果说明,IL-37显著减轻了高糖诱导的HK-2细胞FAO障碍和脂滴沉积。2.IL-37通过调控肉碱棕榈酰转移酶1A(CPT1A)介导的FAO抑制高糖诱导的HK-2细胞纤维化标志物高表达2.1 IL-37上调HK-2细胞CPT1A表达:进一步分析FAO相关的差异基因,发现CPT1A变化明显,据此,检测IL-37对HK-2细胞CPT1A表达的影响。Western blot检测结果发现,30 mmol/L高糖诱导HK-2细胞CPT1A表达降低,而300 ng/m L rec IL-37共孵育则显著抑制了高糖的上述作用。2.2 CPT1A过表达拮抗高糖诱导的HK-2细胞FAO障碍和纤维化标志物高表达:HK-2细胞转染表达CPT1A的质粒后再给以30 mmol/L高糖孵育,并检测各组细胞ATP水平,油红O染色观察细胞脂滴沉积,Western blot检测HK-2细胞纤维化标志物α-SMA和Fibronectin表达水平。结果显示,HK-2细胞CPT1A过表达显著抑制高糖诱导的HK-2细胞ATP水平降低、脂滴沉积和α-SMA、Fibronectin表达升高。以上结果说明,CPT1A过表达可拮抗高糖诱导的HK-2细胞FAO障碍和纤维化标志物高表达。2.3 CPT1A沉默减弱IL-37对高糖诱导HK-2细胞FAO障碍和纤维化标志物高表达的抑制作用:HK-2细胞转染CPT1A siRNA后再予以30 mmol/L高糖和/或300 ng/m L rec IL-37孵育,检测各组细胞ATP水平,油红O染色观察细胞脂滴沉积,Western blot检测HK-2细胞纤维化标志物α-SMA和Fibronectin表达水平。结果显示,CPT1A siRNA干扰效果显著,CPT1A siRNA干扰逆转了IL-37对高糖诱导的HK-2细胞ATP水平降低、脂滴沉积和纤维化标志物表达的抑制作用。以上结果证实,IL-37通过调控CPT1A减轻高糖诱导的HK-2细胞FAO障碍和纤维化标志物高表达。3 IL-37过表达减轻DKD小鼠肾组织CPT1A、FAO相关基因低表达及肾小管上皮细胞脂质沉积以WT和IL-37tg小鼠制备的DKD模型为研究对象,Western blot和肾组织切片免疫组织化学染色观察各组小鼠肾组织CPT1A表达水平,RT-qPCR检测FAO相关基因mRNA表达,同时检测肾小管上皮细胞ATP水平。结果表明,与WT对照组小鼠相比,WT DKD组小鼠肾组织CPT1A和FAO相关基因表达明显下降,ATP水平显著降低,而IL-37tg DKD组小鼠肾组织CPT1A、FAO相关基因表达和ATP水平较WT DKD组小鼠明显增高。不仅如此,肾组织切片脂肪分化相关蛋白(Adipophilin,ADRP)、近端肾小管上皮细胞标志物(Lotus tetragolonobus lectin,LTL)免疫荧光染色和油红O染色发现,与WT对照组小鼠相比,WT DKD组小鼠ADRP表达升高、LTL表达降低、油红O染色面积增加,而IL-37tg DKD组小鼠肾组织上述情况出现了明显改善。这些结果进一步提示,IL-37可以通过减轻肾小管上皮细胞FAO障碍和脂质沉积,进而改善DKD肾间质纤维化。结论:综上所述,本研究发现IL-37在DKD患者肾小管上皮细胞中的表达显著降低,DKD患者肾组织IL-37表达水平与肾间质纤维化程度、SCr、24 h尿蛋白定量呈显著负相关,与eGFR呈显著正相关。IL-37过表达可以显著抑制DKD肾损伤和肾间质纤维化。机制研究证实,IL-37通过调控CPT1A介导的FAO改善DKD肾间质纤维化,因此,本研究为有效防治DKD进展提供了新思路。