研究背景三氯乙烯(TCE)是一种挥发性有机溶剂。部分职业劳动者在暴露TCE后会出现以大面积皮肤粘膜过敏反应为特征并伴有多器官损伤的全身性疾病,这种由TCE诱发的疾病被称为职业性三氯乙烯药疹样皮炎(OMDT)。OMDT患者常伴有免疫性肝损伤、肾损伤和皮肤损伤,其中肾损伤是疾病负担加重的主要原因之一。最近研究表明,血管内皮细胞不仅调节血管张力和抗凝,还具有分泌功能,高迁移率族蛋白B 1(HMGB 1)乙酰化后可以从激活的内皮细胞中释放,随后与晚期糖基化终末产物受体(RAGE)结合,诱导免疫性肾损伤。这使得内皮细胞可能成为肾损伤过程的关键靶点和驱动因素。此外,本研究发现HMGB 1易位现象主要发生在内皮细胞,RAGE主要定位于足细胞。因此,在TCE致免疫性肾损伤中,HMGB 1很可能在内皮细胞和足细胞串扰中起作用,这一潜在作用机制尚不清楚。研究目的探索OMDT患者肾功能、内皮细胞损伤、足细胞损伤及其与HMGB 1和乙酰化HMGB 1(Ac-HMGB 1)的关系。在沉默调节蛋白1(SIRT 1)激活剂SRT1720和RAGE抑制剂FPS-ZM 1干预下建立TCE致敏的OMDT小鼠模型,进一步探讨在TCE所诱导的肾小球损伤中HMGB 1在内皮细胞与足细胞的串扰中的具体作用机制。研究方法人群研究:纳入17例OMDT患者、17例TCE接触未发病对照人群和17例TCE未接触对照人群。通过肌苷酸氧化酶法和脲酶法检测血清肌酐(Cre)和尿素氮(BUN)水平来反映肾小球功能损伤情况;ELISA检测血清内皮素1(ET-1)水平来反映内皮细胞活化情况;ELISA检测尿足细胞糖萼蛋白(PCX)水平来反映足细胞损伤情况;ELISA检测血清SIRT 1、HMGB 1和Ac-HMGB 1水平;Pearson相关系数检验BUN、ET-1、PCX与HMGB 1、Ac-HMGB 1的相关性。动物实验:90只无特定病原体(SPF)级BALB/c雌性小鼠随机分为空白对照组(n=10)、溶剂对照组(n=10)、TCE处理组(n=30)、FPS-ZM 1+TCE处理组(n=20)和SRT 1720+TCE处理组(n=20)。再根据后续的皮肤评分将TCE处理组、FPS-ZM 1+TCE处理组、SRT 1720+TCE处理组进一步分为致敏阳性组和致敏阴性组。小鼠肾脏提取肾小球用作蛋白免疫印迹(WB)。苏木素-伊红染色(HE染色)检测肾脏病理损伤情况。Cre、BUN、胱抑素C(Cys-C)、ET-1、PCX、SIRT 1、HMGB 1和Ac-HMGB 1水平被检测,方法同上。免疫组织化学(IHC)检测ET-1的定位和水平。免疫荧光(IF)检测SIRT 1与PECAM-1、HMGB 1与PECAM-1和RAGE与nephrin的共定位。WB检测肾小球SIRT 1、HMGB 1、Ac-HMGB 1、RAGE、nephrin、podocin、synaptopodin、bax、bcl-2和cleaved-caspase 3水平。免疫共沉淀(Co-IP)检测肾小球核质蛋白HMGB 1与RAGE和HMGB 1与Ac-lysine的相互作用。TUNEL检测足细胞凋亡情况。透射电镜检测足细胞损伤情况。研究结果1、OMDT患者血清Cre、BUN、ET-1、SIRT 1、HMGB 1、Ac-HMGB 1和尿液PCX蛋白水平显著升高。BUN与HMGB 1、Ac-HMGB 1呈正相关。ET-1与HMGB 1、Ac-HMGB 1呈正相关。PCX与HMGB 1呈正相关,与Ac-HMGB 1呈边缘性正相关(P=0.096)。2、小鼠致敏率:空白对照组与溶剂对照组皮肤致敏率为0%;TCE处理组致敏率selleckchem Canagliflozin为36.7%;TCE+FPS-ZM 1处理组致敏率为35%;TCE+SRT 1720处理组致敏率为40%。3、TCE致敏小Empagliflozin配制鼠肾功能及其病理损伤:在TCE致敏阳性组中,血清Cre、BUN和尿液Cys-C表达水平均显著升高。HE染色结果可见TCE致敏阳性组肾小管管腔空泡化,肾小球毛细血管袢扩张,肾小球系膜细胞增生。4、TCE致敏小鼠存在内皮细胞活化:IHC结果显示在TCE致敏阳性组中,ET-1主要位于肾小球内皮细胞上且表达水平显著升高。ELISA结果也证明TCE致敏阳性组血清ET-1水平显著上调。5、在TCE诱导的免疫性肾小球损伤中,SIRT 1通过调控HMGB 1的去乙酰化来抑制内皮细胞中HMGB 1的易位:IF结果显示SIRT 1主要表达于内infections in IBD皮细胞中;WB结果显示,在TCE致敏阳性组中,SIRT 1表达水平明显下调;ELISA结果显示血清SIRT 1表达水平明显上调。IF、WB、ELISA结果显示,在TCE致敏阳性组中,HMGB 1的细胞质易位明显发生在内皮细胞中,细胞核中HMGB 1明显减少,细胞质中HMGB 1明显增加,血清中HMGB 1明显增加。WB和ELISA结果均显示,在TCE致敏阳性组中,Ac-HMGB 1表达水平显著升高。6、在TCE诱导的免疫性肾小球损伤中,SIRT 1调控Ac-HMGB 1和RAGE的相互作用:Co-IP结果显示,在TCE致敏阳性组中,HMGB 1蛋白与RAGE蛋白发生共沉淀,在细胞质中有较强的相互作用;然而,SRT 1720处理显著减弱了相互作用。我们还发现,在TCE致敏阳性组中,HMGB 1在细胞核和细胞质中发生了乙酰化,但在细胞核中HMGB 1的乙酰化水平无统计学差异。7、在TCE诱导的免疫性肾小球损伤中,FPS-ZM 1调控足细胞特异性标记蛋白和膜受体RAGE:IF和WB结果显示RAGE定位于足细胞上,并且在TCE致敏阳性组中,RAGE的表达水平显著上调。WB和ELISA结果显示TCE致敏阳性组肾小球podocin、nephrin和synaptopodin蛋白表达水平明显降低,尿液PCX表达水平明显升高;FPS-ZM 1处理后podocin、nephrin和synaptopodin表达水平上升,PCX表达水平降低。8、SRT 1720和FPS-ZM 1抑制了TCE致敏所诱导的肾小球足细胞凋亡:WB结果显示,在TCE致敏阳性组中,bax和cleaved-caspase 3表达水平明显升高,bcl-2表达水平明显降低;而FPS-ZM 1处理后bax和cleaved-caspase 3表达水平下调,bcl-2表达水平上调。电镜结果显示,在TCE致敏阳性组中,足细胞足突消失、广泛融合;但是在SRT 1720和FPS-ZM 1处理后足细胞损伤减轻。TUNEL结果显示,在TCE致敏阳性组中,足细胞存在明显的凋亡;但是SRT1720和FPS-ZM 1处理后足细胞凋亡减轻。研究结论在TCE致敏肾小球损伤中,HMGB 1发生了乙酰化,其在内皮细胞发生核质易位并分泌到细胞外,与足细胞膜受体RAGE相互作用,导致足细胞凋亡。干预HMGB 1的上下游通路部分阻断了内皮细胞和足细胞之间的串扰。即上游激活SIRT 1,减少HMGB 1的乙酰化和核质易位;下游抑制RAGE,减少HMGB 1与RAGE的结合,从而减轻肾小球足细胞的损伤。