研究背景:急性肾损伤(Acute kidney injury,AKI)是一种以肾功能急剧下降为特征的临床危重症,主要表现为近端小管损伤以及血清肌酐和尿素氮水平升高,具有较高的发病率和死亡率。临床大数据随访研究发现,19%～31%AKI患者逐渐演变为慢性肾脏病(CKD,Chronic kidney disease),最终进展至尿毒症状态。尽管开展了大量的AKI研究,但AKI发生发展的内在机制尚未完全阐明,临床也缺乏治疗手段干预AKI向CKD转变,这是临床AKI救治面临的重大难题之一。大量的证据表明,肾小管损伤是AKI的典型特征,而肾小管损伤修复不良是AKI向CKD转变的主要诱发因素。据文献报道及我们课题组的研究发现,AKI中肾小管上皮细胞损伤的主要机制包括缺氧、细胞周期阻滞、持续氧化应激、焦亡、线粒体失能等。值得注意的是,急性肾小管缺氧是缺血再灌注损伤(Ischemia reperfusion injury,IRI)诱导AKI的典型特征。最近的研究表明,铁死亡作为一种新近发现的死亡方式参与了AKI的发生与发展。铁死亡是一种铁依赖性的细胞死亡,主要表现为铁离子蓄积、脂质活性氧增多、铁死亡抗氧化系统失调和线粒体损伤。有研究发现,敲除谷胱甘肽过氧化物酶(glutathion peroxidase 4,GPX4)能诱导小鼠出现AKI的特征,而敲除铁死亡的另一标志物长链脂肪酸辅酶a连接酶4(Long-chain-fatty-acid—Co A ligase 4,ACSL4)能缓解AKI,而且新近研究发现铁死亡抑制剂(如Ferrostatin-1和Lipostatin-1)可预防AKI,但是铁死亡在AKI中的致病机制仍未完全阐明。阻遏因子1沉默转录因子(Repressor element 1-silencing transcription factor,REST)是一种转录抑制因子,通过结合到靶基因的启动子区调节染色质结构或抑制基础转录对靶基因进行调控。早期的研究显示REST参与神经分化以及神经发育的调控,近年来,REST展现出越来越多的生物学功能,且具有细胞特异性。据报道,REST是缺氧时基因表达抑制的主要调节因子,可抑制20%的缺氧相关基因,这提示REST可能在AKI中发挥重要作用。最新的研究报道了REST参与脑IRI的病理过程,但其在IRI诱导AKI中的作用和机制尚不清楚。本研究以肾小管上皮细胞REST特异性敲除小鼠以及原代肾小管上皮细胞为研究对象、采用缺氧复氧(Hypoxia and reoxygenation,HR)损伤下敲低REST的转录组测序、透射电镜、流式检测ROS等方法,首先明确了REST在各种AKI模型中的表达上调,且基因敲除模型证实敲除REST能显著缓解AKI及其向CKD进展。随后,转录组测序以及相关功能实验发现,敲低肾小管上皮细胞REST能通过缓解铁死亡而减轻HR损伤。机制研究表明,REST通过转录调控谷氨酸胱氨酸连接酶修饰亚基(Glutamic cystine ligase modified subunit,GCLM)促进谷胱甘肽(Glutathione,GSH)生成缓解铁死亡。最后,我们利用基因敲除小鼠模型证实了敲除REST不但缓解IRI诱导的肾损伤,还可以延缓AKI向CKD的进展。因此,本研究揭示了REST的新功能及其作用机制。研究目的:探讨肾小管上皮细胞特异性敲除REST通过抑制铁死亡从而缓解AKI的作用和机制,明确靶向干预REST/GCLM/GSH信号通路对铁死亡及AKI向CKD转化的治疗效果。研究方法:1.体外研究(1)在人肾小管上皮细胞(HK-2),小鼠原代肾小管上皮细胞(Renal tubular epithelial cells,RTECs),大鼠肾小管上皮细胞(NRK52E)建立HR模型以及顺铂毒性模型,通过Western blot评估REST的表达水平改变。(2)通过si RNA敲低REST在HK-2细胞的表达并暴露在HR损伤下,采用q PCR、转录组测序、Western blot、PI/Calcein-AM染色、乳酸脱氢酶(Lactic dehydrogenase,LDH)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、GSH、谷氨酸胱氨酸连接酶(Glutamic cystine ligase,GCL)、活性氧(Reactive oxygen species,ROS)、脂质ROS以及透射电镜检测等方法确定敲低REST对铁死亡的作用。采用铁死亡诱导剂Erastin和RSL3处理细胞后评估铁死亡相关指标,验证敲低REST对铁死亡的抑制作用。selleck产品采用铁死亡抑制剂Ferrostatin-1以及DFO处理细胞后检测铁死亡相关的指标,探究敲低REST与铁死亡抑制剂的协同作用。(3)通过从REST~(flox/flox)小鼠提取原代肾小管上皮细胞并感染含有Cre酶的腺病毒以敲除REST,在此基础上干扰GCLM并诱导HR损伤,采用q PCR、Western blot、MDA、GSH、GCL、脂质ROS以及透射电镜等方法以探究REST/GCLM轴的干预对铁死亡的作用。此外通过双荧光素酶报告系统、结合位点点突变和免疫共沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation,Ch IP)探究REST对GCLM的转录调控。2.体内研究(1)分别通过IRI手术以及顺铂腹腔注射建立AKI模型,通过Western blot、免疫荧光等方法评估REST的表达水平。利用REST~(RTKO)小鼠建立IRI诱导的AKI模型,明确REST在肾小管上皮细胞的敲除对AKI中的作用,同时通过IRI手术即刻注射铁死亡抑制剂Ferrostatin-1,评估和REST~(RTKO)缓解AKI的协同效应。通过血清学检测肌酐以及尿素氮、q PCR实验、HE染色评估肾损伤程度。采用免疫荧光染色、Western blot评估REST的表达水平。(2)利用透射电镜技术观察肾小管上皮细胞的线粒体损伤、Western blot检测铁死亡相关蛋白表达、组织匀浆检测GSH、MDA、GCL活性等,探讨在肾小管上皮细胞敲除REST对AKI中铁死亡的影响。(3)在对照小鼠以及REST~(RTKO)小鼠建立IRI诱导的AKI to CKD模型,通过检测血清学指标肌酐、尿素氮,通过HE染色、MASSON染色、Western blot以及免疫组化评估纤维化程度以探究在肾小管上皮细胞敲除REST对AKI向CKD转化的影响。3.临床数据分析通过收集病理诊断为急性肾小管坏死(Acute tubular necrosis,ATN)肾活检标本以及肾肿瘤病人的癌旁组织行REST的免疫组化染色,并与血清肌酐、尿素氮相关性分析评估REST表达和肾损伤的关系。研究结果以及结论1.在AKI状态下,REST表达显著升高首先,在HK-2,NRK52E以及小鼠的原代肾小管上皮细胞中,HR处理和顺铂处理均能显著地诱导REST蛋白表达上调。其次,在IRI诱导的AKI小鼠模型和顺铂处理介导的AKI小鼠模型中,REST在m RNA和蛋白水平的表达均显著升高。最后,对临床肾活检AKI标本中,REST表达水平也显著升高,而且与血清肌酐、尿素氮水平均呈正相关。2.肾小管上皮细胞特异性敲除REST基因显著缓解IRI介导的AKI采用REST~(RTKO)小鼠以及REST~(flox/flox)小鼠建立IRI诱导的AKI模型,1天后取材检测肾损伤。通过肾组织HE染色、血清肌酐和尿素氮检测、q PCR检测肾组织中肾损伤相关标志物,发现在肾小管上皮细胞特异性敲除REST小鼠中,AKI显著缓解,肾功能得到明显恢复。这些结果提示REST上升加重AKI损伤。3.敲低REST表达能缓解HR损伤介导的肾小管上皮细胞铁死亡HK-2细胞敲低REST后经HR处理,PI/Calcein-AM染色、细胞活度以及LDH检测提示敲低REST显著缓解细胞死亡,转录组测序的结果提示敲低REST缓解HR损伤中的铁死亡。透射电镜观察到在HR组中,大量的线粒体固缩,密度增大,外膜破坏,线粒体嵴减少,呈现出显著的铁死亡特征,而REST干扰组显著改善这种线粒体破坏。此外,REST干扰组明显增加GSH生成水平,且减少MDA、ROS、以及脂质ROS的蓄积。为了进一步探索敲低REST对铁死亡的抑制作用,我们通过Erastin以及RSL3诱导HK-2中的铁死亡,LDH以及PI/Calcein-AM检测发现敲低REST显著缓解了RSL3诱导的铁死亡。为了探究REST的缺乏与铁死亡抑制剂的关系,我们在HK-2细胞中孵育铁死亡抑制剂Ferrostatin-1以及DFO并暴露在HR损伤下,GSH、MDA、脂质ROS检测发现敲低RESTY-27632浓度、Ferrostatin-1、DFO都显著缓解了HR损伤中的铁死亡,且敲低REST与Ferrostatin-1以及DFO存在协同作用。这些结果表明,REST能显著缓解HR模型介导的铁死亡。4.敲低REST通过上调GCLM缓解铁死亡为了探究REST调控铁死亡的机制,我们进一步通过q PCR检测了转录组测序中敲低REST后显著上调前10的基因,发现只有GCLM在体内以及体外均被敲低REST显著上调。通过小鼠原代肾小管上皮细胞中诱导REST敲除发现,在此基础上干扰GCLM使恢复的GCL活性、GSH、MDA、脂质ROS水平以及透射电镜下的线粒体损伤再次加重。这些结果提示REST缺乏可能通过促进GCLM表达使GSH生成增加从而抑制铁死亡。5.REST直接结合于GCLM基因启动子区抑制GCLM转录为了探究REST调控GCLM的机制,我们通过JASPR数据库预测了REST在GCLM启动子区域的结合位点,并根据结合位点设计了包含不同长度启动子区域的报告质粒。双荧光素酶报告系统以及Ch IP实验表明REST通过与GCLM启动子区域(-152～-132,gccgcaggccaagggccagtc)结合抑制GCLM的转录。6.肾小管上皮细胞特异性敲除REST缓解铁死亡及其介导的AKI,并延缓AKI向CKD转变采用特异性基因敲除小鼠,建立AKI模型并检测肾功能以及铁死亡相关指标。我们发现和对照小鼠相比,REST~(RTKO)小鼠中铁死亡被显著缓解。在此基础上,我们进一步采用铁死亡抑制剂Ferrostatin-1治疗AKI。肾功能检测、病理学染色、以及铁死亡相关指标的检测发现,REST的特异性敲除与Ferrostatin-1存在协同效应,但是Ferrostatin-1并不能恢复GCLMMedicopsis romeroi的表达水平,这进一步提示了敲除REST基因能提高GCLM表达增强GCL活性,恢复GSH生成的独特作用。由于AKI是CKD的独立风险因素,我们进一步探索肾小管敲除REST是否延缓AKI向CKD的转变。为此,采用REST肾小管上皮细胞敲除小鼠及其对照,建立了IRI诱导的AKI to CKD模型。HE染色、Masson染色、α-SMA以及Fibronectin的免疫组化表明,肾小管上皮敲除REST可显著恢复肾功能以及延缓纤维化进程,同时GCLM以及GPX4也被显著的缓解。这些结果表明肾小管上皮敲除REST可恢复GCLM的表达,从而缓解AKI且延缓AKI向CKD的进程。研究结论本研究中,我们进行了一系列体外和体内实验,证实REST在AKI损伤后表达上调,直接结合于GCLM基因启动子区而抑制其转录,导致GSH和GPX4下调,从而促进脂质过氧化和铁死亡,最终诱导AKI及其向CKD转化。而敲除肾小管上皮细胞的REST基因则能显著改善上述效应。本课题阐明了转录因子REST及其靶基因GCLM在铁死亡介导的AKI向CKD转化中的重要作用,提示REST及其介导的铁死亡有望成为AKI的潜在治疗靶点。意义本研究通过解析REST在AKI及其向CKD进展中的生物学作用,阐释了AKI的发病新机制,为临床AKI的治疗提供新线索。