目的:随着我国社会发展和医疗水平的不断提高,人民预期寿命逐渐延长,我国即将步入老龄化社会。认知功能的减退是衰老最明显的特征之一,预防和改善衰老过程中认知功能的减退是老龄化社会的一个巨大挑战。早在人生的第三个十年,人类的核心认知能力,包括处理速度、推理、情景记忆和空间可视化能力就已经开始下降。多元增长曲线模型显示认知功能的减退不是老年期的急剧下降,而是在整个生命周期中持续小幅的下降。因此早期、长时程的干预对于预防和改善衰老造成的认知功能减退是十分重要的。目前的观点认为早在痴呆症状出现前的20年或更早就已经出现神经病理的改变,并且这种病理改变一旦出现就很难被逆转。因此,我们需要寻找一种临床处方量大、干预时间早、治疗时程长的干预手段作为研究的目标更符合临床实际情况且更具现实意义。近年来大量的研究发现使用他汀类药物可有效地减少认知能力下降及神经退行性疾病的发生。基于目前的循证医学证据,大量人群从中年就开始长期服用他汀类药物,其主要目的是降脂或稳定斑块,而此时他们几乎未出现过认知减退的症状。目前许多临床研究几乎都只观察了服用他汀类药物对患者几年内的效应,而长期服用他汀类药物对机体整体功能的影响,包括认知功能的长远影响目前尚不清楚。因此,本研究选择他汀类药物作为干预手段是最符合目前临床用药情况和病理生理机制的。综上,本研究使用阿托伐他汀对自然衰老的大鼠进行早期、长时程干预以探究治疗认知功能减退的潜在靶点。蛋白质翻译后修饰在各种生物途径中发挥着重要的作用,调控众多重要的细胞过程,包括酶的激活、蛋白质的定位和降解。赖氨酸巴豆酰化是一种近年来新发现的组蛋白翻译后修饰,可以参与细胞代谢、细胞周期和细胞重组过程。同时有研究揭示了巴豆酰化在认知功能障碍中起到调控表观遗传的作用。鉴于此,本研究在前两部分进行了蛋白质组学及巴豆酰化修饰组学研究,并对发现的潜在治疗靶点进行机制研究。微生物-肠道-大脑轴在神经系统的调控中发挥着重要作用。最近的一些研究证实,肠道菌群、脑部炎症和认知障碍是密切相关的。阿托伐他汀已被发现可以减少神经炎症的损害,并改善小鼠的认知功能。然而,阿托伐他汀是否能通过微生物-肠道-大脑轴来减少神经炎症仍不清楚。因此本研究在第三部分探究了微生物-肠道-大脑轴参与该效应的机制。综上,本研究拟采用不同剂量的阿托伐他汀对自然衰老的大鼠模型进行长期干预。通过蛋白质组学、蛋白质修饰组学Alpelisib临床试验、宏基因组微生物分类测序的方法探究长期阿托伐他汀对认知功能影响的潜在靶点,并探究其发生机制。研究方法:本研究共分三个部分:第一部分通过认知行为学、蛋白质组学研究探索长期他汀干预改善认知功能的潜在靶点;第二部分通过细胞学实验探索机制;第三部分通过肠道微生物组及免疫学实验探究长期他汀干预改善认知功能与微生物-肠道-大脑轴的机制。第一部分:采用成年雄性SD大鼠(9月龄)共30只进行研究。随机分为对照组(生理盐水0.5ml/d灌胃,10只)、低剂量组(阿托伐他汀2.1mg/kg·d~(-1)灌胃,10只)、高剂量组(阿托伐他汀8.4mg/kg·d~(-1)灌胃,10只)。分别通过Y迷宫实验、新事物识别实验、Morris水迷宫实验三种方法对大鼠的认知行为学进行评估;基于蛋白质组学及蛋白质修饰组学技术,通过GO分析等方法对差异蛋白进行筛选;通过蛋白质印记法对筛选出的蛋白进行验证,并通过单分子免疫阵列分析对相关血液指标进行检测;通过免疫荧光双染的方法进行定位分析。第二部分:分离培养大鼠海马神经元细胞,并通过免疫共沉淀、细胞转染、蛋白质印记法、PCR反应等方法对神经丝轻链(neurofilament light chain,NFL)的多种修饰调控及相关位点进行了研究。第三部分:通过16s RNA微生物组测序及微生物群落分析对大鼠肠道菌群进行了分析;根据菌群的分析结果进一步通过细胞分离实验、流式细胞检测、液相色谱-质谱联用、蛋白质印记法、PCR、免疫荧光染色等方法探究他汀类药物通过微生物-肠道-大脑轴改善认知功能的机制。结果:1.行为学及蛋白质组学结果:Y迷宫实验、新事物识别实验结果均显示短期(3个月)干预未对大鼠认知功能评分产生明显影响;而长期干预(9个月)时,高剂量阿托伐他汀干预组的认知功能评分明显高于对照组。Morris水迷宫实验结果显示高剂量阿托伐他汀干预组的空间学习能力及空间记忆能力均显著高于对照组。蛋白质组学结果发现高剂量阿托伐他汀干预会显著下调NFL的蛋白表达量;巴豆酰化修饰组学结果显示高剂量阿托伐他汀干预会显著下调NFL在K272位点上的巴豆酰化修饰水平。结合上述结果,筛选出NFL作为本研究的目的蛋白,并通过蛋白质印记法对组学结果进行验证。同时我们使用单分子阵列技术对血液中的NFL进行测定,结果显示高剂量他汀干预组血清中的NFL较对照组明显下降。为了验证NFL与认知功能衰退的关系,通过免疫荧光双染对NFL和神经纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFT)进行了共定位,各组结果均显示NFL与NFT共定位重合度极高并随着年龄的增长而增多,在给予阿托伐他汀干预后下降,其中高剂量干预组的趋势更为显著。2.细胞学实验验证结果:通过数据库分析发现在NFL的K272位点上同时存在泛素化修饰,通过免疫共沉淀方法验证了长期阿托伐他汀干预可以下调NFL的巴豆酰化水平并上调NFL的泛素化水平。免疫共沉淀联合质谱分析筛选出沉默调节蛋白2(silenMyoglobin immunohistochemistryt information regulator 2,SIRT2)可能与NFL发生蛋白互作,并通过免疫共沉淀实验发现长期阿托伐他汀可以提高SIRT2与NFL的互作并能提高SIRT2的酶活性。通过SIRT2特异性抑制剂AGK2处理神经元细胞后,NFL的蛋白表达量上升、巴豆酰化水平上升,而泛素化水平下降。神经元细胞SIRT2过表达后,NFL的巴豆酰化水平下降,泛素化水平上升。阿托伐他汀可以通过SIRT2调控NFL的巴豆酰化水平及泛素化水平。对NFL K272位点进行突变后,NFL的巴豆酰化水平总体下降,泛素化水平总体无明显变化。在过表达SIRT2后,可以上调NFL的泛素化修饰水平,而在NFL K272位点突变后,过表达SIRT2造成的泛素化修饰水平升高程度显著降低。3.肠道微生物组及免疫学研究结果:液相色谱-质谱联用结果显示高剂量干预组的视黄酸(retinoic acid,RA)、视黄醇(retinol,ROH)及视黄醇脱氢酶7(retinol dehydrogenase 7,Rdh7)的表达水平显著高于对照组,视黄酸酯(retinyl esters,RE)则显著减少。流式细胞分析结果显示高剂量干预组的调节性T细胞(Regulatory cells,T_(reg))显著高于对照组,而IL-17~+γδT显著低于对照组。高剂量干预组海马组织中白细胞介素17(interleukin 17,IL-17)明显低于对照组。大鼠粪便16s RNA微生物组测序及微生物群落分析中α多样性分析结果显示高剂量干预组的ACE指数、observed species指数、PD whole tree指数均显著高于对照组。β多样性分析结果发现高剂量干预组与其余各组的菌群有显著差异,在基线时大鼠肠道菌群的显著差异菌为梭状芽孢杆菌、疣微菌,而在长期高剂量干预后的显著差异菌为乳酸菌和巴氏杆菌。结论:1.长期高剂量阿托伐他汀干预显著改善了自然衰老大鼠的认知功能减退。2.长期阿托伐他汀干预通过增加SIRT2的表达下调NFL K272位点的巴豆酰化修饰水平,进而上调泛素化修饰水平使NFL表达降低,最终减少NFT来改善认知功能。3.长期阿托伐他汀干预可以增加肠道菌群多样性,并增加益生菌群的丰度。4.长期阿托伐他汀干预可以改变Rdh7在肠道的表达来影响RA的代谢,进而导致肠道T_(reg)细胞的增殖并抑制IL-17~+γδT细胞的功能,最终减少IL-17在海马区Naporafenib的表达来改善认知功能。