背景及目的:自身免疫性疾病是影响全球数百万人的免疫系统慢性疾病,严重时甚至会导致死亡。目前临床上的治疗方法往往很难做到根治疾病并且长期使用还会降低机体自身的免疫反应,增加感染和罹患癌症的风险。免疫耐受是防止免疫系统对自身发生反应的必要条件,通过靶向在抗原呈递细胞上和T细胞上表达的共刺激分子有望通过调节T细胞功能实现免疫耐受诱导,在自身免疫性疾病治疗中具有潜力。CD40广泛表达于抗原提呈细胞表面,与其配体CD40L组成的共刺激途径对于自身免疫性疾病中的T细胞激活至关重要,通过阻断CD40途径可以抑制过度的免疫反应实现免疫耐受。针对CD40L的抗体的开发由于在临床试验中引发血栓的发生而被停止。开发针对CD40途径的替代治疗方法至关重要。RNA干扰(RNAi)是指在生物体内通过攻击细胞中目标基因的m RNA导致基因表达沉默。引入外源性合成的小干扰RNA(siRNA),通过特定的碱基互补配对可以诱导RNAi发生,对疾病相关基因有特异性和高效的敲除作用。然而siRNA在体内面临细胞内吞效率低、易被核酸酶降解等难题,需要一个载体来保护并有效的将它们递送到目标细胞。纳米输运系统成为了一个理想的解决办法。纳米颗粒因为其灵活的尺寸、结构和可改变的表面修饰,在递送siRNA上显示出巨大潜力。已有研究证明利用PEG-PLGA纳米颗粒作为CD40siRNA的载体可以靶向抗原提呈细胞,诱导免疫耐受产生,在同种异体皮肤移植排斥实验和实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)模型中起到了治疗效果。但是单纯利用NPs/siCD40进行治疗疗效有限,需要联用免疫抑制剂或其他siRNA来提升治疗效果。研究表明在PEG末端进行马来酰亚胺官能团修饰,通过马来酰亚胺-巯基反应可以提高纳米颗粒在体内的循环时间和靶向能力,因此考虑能否通过对PEG-PLGA纳米颗粒进行马来酰亚胺官能团修饰提升纳米颗粒输运系统靶向递送siRNA效率,并提升对自身免疫性疾病的治疗效果。本研究的目的是通过马来酰亚胺官能团修饰优化纳米颗粒,提升纳米输运系统递送siRNA的效率和在体内和体外水平降低树突状细胞CD40表达水平的能力,提高对于EAE的治疗效果。研究方法:本研究首先通过双乳化法合成包载siRNA的Mal-PEG-PLGA纳米颗粒和PEG-PLGA纳米颗粒,应用动态光散射仪(dynamic light scatterer,DLS)对纳米颗粒的粒径和表面电势进行表征。将Mal-NPs/Cy5-siNC、NPs/Cy5-siNC与骨髓来源树突状细胞共培养,随后应用流式细胞术检测两种纳米颗粒在体外递送siRNA的能力。将Mal-NPs/siCD40、NPs/siCD40与DC1.2和RAW264.7细胞共培养,应用流式细胞术和q PCR检测细胞上CD40表达。C57BL/6小鼠尾静脉注射Mal-NPs/Cy5-siNC和NPs/Cy5-siNC,应用小动物活体成像仪检测纳米颗粒在小鼠体内的分布情况、应用流式细胞术检测纳米颗粒在外周血、脾脏、骨髓中DC和巨噬细胞中的分布情况。C57BL/6小鼠在尾静更多脉注射Mal-NPs/siCD40、NPs/siCD40后处死,分离骨髓细胞后体外诱导骨髓来源树突状细胞,使用LPS刺激,应用流式细胞术检测树突状细胞的比例和CD40表达水平。应用EAE小鼠模型验证Mal-NPs/siCD40的生物学效果。研究结果:1.通过双乳化法制备Mal-NPs/siCD40和NPs/siCD40,其粒径分别为149.33±3.57nm和95.34±3.75 nm,表面电势分别为37.4±0.79m V和37.7±0.70 m V。2.MTamoxifen体内实验剂量al-NPs/siCD40能够在体外向骨髓诱导树突状细胞递送siRNA,与NPs/siCD40相比,Mal-NPs/siCD40在体外沉默细胞CD40表达的能力更强。3.与NPs/Cy5-siNC相比,Mal-NPs/Cy5-siNC在小鼠主要脏器,以及小鼠DC和巨噬细胞中富集更高。4.与NPs/siCD40相比,Mal-NPs/siCD40抑制骨髓细胞分化和沉默CD40表达的能力更强。5.与NPs/siCD40相比,Mal-NPs/siCD40对于EAE模型的治疗效果更好。结论:本研究利用双乳化法成功制备包载siRNA的马来酰亚胺修饰的PEG-PLGA纳米颗粒(Mal-NPsMedical organization/siCD40)。马来酰亚胺修饰增强PLGA纳米颗粒在小鼠主要脏器中的富集,并提高靶向树突状细胞和巨噬细胞递送siRNA的效率。马来酰亚胺修饰提高NPs/siCD40沉默树突状细胞中CD40表达的能力,并在EAE模型中取得更好地疗效。