目的:观察健脾活血方对脾虚血瘀型慢性萎缩性胃炎(Chronic atrophic gastritis,CAG)癌前病变临床症候、胃镜及病理积分的疗效。应用1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(Methylnitronitrosoguanidine,MNNG)致人胃黏膜上皮细胞(Human Gastric mucosal Epithelial Cells,GES-1)恶性转化,建立胃癌前病变(Precancerous lesion of gastric cancer,PLGC)细胞模型(MC细胞),并通过全转录组测序技术检测健脾活血方干预前后MC细胞mRNAs及lncRNAs的表达差异,探讨健脾活血方治疗CAG癌前病变可能的作用机制。方法:1.临床研究收集2019年04月至2022年6月就诊于江苏省中医院普内科门诊及病房,符合脾虚血瘀型CAG癌前病变的患者共92例,通过数字随机法将患者分为试验组和对照组,试验组脱落3例,最终病例数为43例,对照组脱落5例,最终病例数为41。试验组予健脾活血方(黄芪15g、炒白术10g、炒苡仁15g、莪术10g、炒枳壳10g、佛手10g、鸡内金10g、石见穿15g等,由江苏省中医院中药房提供),每日1剂,水煎2次,每次200ml,早晚饭后1小时服用。对照组予口服叶酸片5mg(常州制药厂有限公司批号:H32023302),每日3次,每次1片,疗程均为12周。观察两组患者治疗前后的临床症候、胃镜及病理积分变化,进行统计学分析。2.实验研究2.1健脾活血方对MNNG致GES-1恶性转化细胞(MC细胞)生长、迁移及侵袭的体外抑制作用首先,设立人胃黏膜上皮细胞GES-1细胞为空白对照,以MTT法检测MNNG、健脾活血方及叶酸对GES-1细胞的活力影响,筛选出适合的干预浓度及干预时间。应用MNNG致GES-1细胞恶性转化,构建PLGC细胞模型(MC细胞)。使用健脾活血方水提液及叶酸溶液对MC细胞进行分组干预:第一组:GES-1+MNNG(MC细胞);第二组:GES-1+MNNG+健脾活血方低浓度(L);第三组:GES-1+MNNG+健脾活血方中浓度(M);第四组:GES-1+MNNG+健脾活血方高浓度(H);第五组GES-1+MNNG+叶酸。通过MTT检测、细胞划痕实验、Transwell侵袭实验分别观察不同浓度健脾活血方对MC细胞活力、迁移、侵袭能力的干预作用,并在光镜下观察对MC细胞形态的影响。2.2健脾活血方在MC细胞中的转录组学研究使用健脾活血方对MC细胞进行干预,对样本细胞进行RNA提取、纯化、文库构建和质检。运用全转录组测序技术检测经健脾活血方干预前后MC细胞的mRNAs和lncRNAs的表达差异并进行GO富集分析及KEGG富集分析,寻找健脾活血方可能调节的信号通路,为后续细胞实验提供依据。2.3健脾活血方通过TGF-β 1/Smad3/CTGF信号轴抑制MC细胞EMT的机制研究2.3.1 TGF-β 1激动剂对MC细胞生长、迁移、侵袭的影响及健脾活血方的干预作用通过MTT检测、细胞划痕实验、Transwell侵袭实验观察健脾活血方对TGF-β 1激动剂刺激后MC细胞活力、迁移、侵袭能力的干预作用,并在光镜下观察健脾活血方对TGF-β 1激动剂刺激后MC细胞形态的影响。具体分组:第一组:GES-1+MNNG(MC细胞);第二组:GES-1+MNNG+健脾活血方高浓度(H);第三组:GES-1+MNNG+TGF-β1激动剂;第四组:GES-1+MNNG+TGF-β 1激动剂+健脾活血方高浓度(H)。2.3.2健脾活血方对TGF-β 1/Smad3/CTGF信号轴及MC细胞的EMT抑制作用Western Blot 检测健脾活血方对 MC 细胞 TGF-β 1、Smad3、CTGF、E-cadherin、Vimentin蛋白表达的影响,并检测TGF-β 1激动剂刺激后MC细胞在健脾活血方干预前后各蛋白的表达情况。具体分组:第一组:GES-1+MNNG(MC细胞);第二组:GES-1+MNNG+健脾活血方低浓度(L);第三组:GES-1+MNNG+健脾活血方中浓度(M);第四组:GES-1+MNNG+健脾活血方高浓度(H);第五组GES-1+MNNG+叶酸;第六组:GES-1+MNNG+TGF-β 1激动剂;第七组:GES-1+MNNG+TGF-β 1激动剂+健脾活血方高浓度(H)。结果:1.临床研究1.1临床疗效比较试验组的总有效率为83.72%,对照组的总有效率为58.54%,试验组高于对照组,两组组间比较具有统计学意义(P<0.05)。1.2中医证候疗效比较试验组的总有效率为88.37%,对照组的总有效率为60.98%,试验组高于对照组,两组组间比较具有统计学意义(P<0.05)。1.3中医证候积分比较:两组中医证候总积分治疗后均下降,具有统计学意义(P<0.05),两组治疗后中医证候总积分组间比较,试验组低于对照组,具有统计学意义(P<0.05)。在中医证候各单项积分方面,两组治疗后胃脘隐痛、胃脘痞胀、食少纳呆、大便稀溏、倦怠乏力、气短懒言及食后脘闷等积分均下降(P<0.05),除大便稀溏外,其余中医证候各单项积分治疗后组间比较,试验组均低于对照组,具有统计学意义(P<0.05)。而两组治疗后大便稀溏积分组间比较无统计学意义(P>0.05)。1.4胃镜及病理疗效两组胃镜下胃黏膜积分治疗后均下降,具有统计学意义(P<0.05),两组治疗后胃黏膜积分组间比较,试验组低于对照组,具有统计学意义(P<0.05)。在组织病理学疗效上,两组治疗后胃黏膜萎缩、肠上皮化生、活动性及慢性炎症积分均下降(P<0.05),并且两组患者治疗后各项积分组间比较,试验组均低于对照组,具有统计学意义(P<0.05)。在异型增生方面,治疗后两组均有改善,但无统计学意义(P>0.05)。2.实验研究2.1健脾活血方对MC细胞生长、迁移及侵袭的体外抑制作用MTT检测显示:与空白组相比,各浓度的MNNG干预后GES-1细胞的活性显著下降,具有统计学意义(P<0.05)。随着MNNG浓度的增加,GES-1细胞的活性逐渐下降,呈浓度及时间依赖性。当MNNG浓度为40μmol/L时对GES-1细胞的抑制率约为20%。根据参考文献及预实验结果,设定后续实验MNNG干预浓度为40μmol/L,干预时间为48h;与空白组相比,各浓度健脾活血方及叶酸溶液干预后GES-1细胞的活性显著增加,具有统计学意义(P<0.05),并且随着浓度增加GES-1细胞活性逐渐增加,呈浓度依赖及Docetaxel纯度时间依赖。设定后续实验健脾活血方低、中、高干预浓度分别为4、8和16 mg/mL,干预时间均为48h。叶酸溶液的干预浓度为1μg/mL,干预时间为48h。正常的GES-1细胞在培养皿中附壁生长,细胞外形呈梭形,形态规则。加入MNNG干预后可见部分细胞死亡,说明MNNG具有细胞毒性。伴随干预时间增加,存活的细胞形态逐渐不规则,呈多角形,并且聚集生长,排列紧密错乱呈“岛样”,胞浆内见空泡,说明MC细胞造模成功。与GES-1+MNNG组(MC细胞)相比,各浓度的健脾活血方和叶酸溶液干预后MC细胞形态改善,周边毛刺状减少,多角形态减少,排列较前规则,死亡细胞数目逐渐减少,并且细胞活性、细胞迁移率及侵袭能力显著下降,具有统计学意义(P<0.05);与GES-1+MNNG+叶酸组相比,高浓度健脾活血方干预后MC细胞活性、迁移率及侵袭均显著下降,具有统计学意义(P<0.05)。2.2健脾活血方在MC细胞中的转录组学研究MC细胞经健脾活血方干预后检测出差异mRNAs共324个,上调mRNAs为172个,下调mRNAs为152个;差异lncRNAs共845个,上调lncRNAs为468个,下调lncRNAs为377个。差异的mRNAs通过KEGG富集分析富集到与CAG“炎-癌”转化密切相关的信号通路包括:PPAR信号通路、ErbB信号通路、Wnt信号通路、IL-17信号通路、EGFR信号通路、JAK-STAT信号通路、TNF信号通路、PI3K-Akt信号通路及TGFChild psychopathology-β信号通路。其中 TGF-β 1 信号通路中 ENSG00000125378 上调,而 ENSG00000136997、ENSG00000163235、ENSG00000281453 下调。2.3健脾活血方通过TGF-β 1/Smad3/CTGF信号轴抑制MC细胞EMT的机制研究2.3.1 TGF-β 1激动剂对MC细胞生长、迁移、侵袭的影响及健脾活血方的干预作用与GES-1+MNNG组(MC细胞)相比,经TGF-β 1激动剂干预后MC细胞的形态变得更加不规则,胞体变大,呈多角形,排列絮乱,“岛样”聚集生长增加,且细胞活性、迁移及侵袭显著增加,具有统计学意义(P<0.05);与GES-1+MNNG+TGF-β 1激动剂组相比,TGF-β 1激动剂刺激的MC细胞经健脾活血方干预后形态改善,细胞周边毛刺状减少,多角形态减少,排列较前规则,死亡细胞数目逐渐减少,排列较前有序,“岛样”聚集生长减少,且细胞活性、迁移及侵袭显著下降,具有统计学意义(P<0.05)。2.3.2健脾活血方对TGF-β 1/Smad3/CTGF信号轴及MC细胞EMT的抑制作用Western Blot检测显示:与GES-1+MNNG组(MC细胞)相比,各浓度的健脾活血方及叶酸溶液干预后MC细胞的TGF-β 1、Smad3、CTGF、Vimentin表达显著下降,E-cadherin水平显著升高,具有统计学意义(P<0.05);与GES-1+MNNG+叶酸组相比,高浓度健脾活血方干预后MC细胞的TGF-β 1、Smad3、CTGF、Vimentin蛋白表达水平显著下降,E-cadherin蛋白表达水平显著升高,具有统计学意义(P<0.05);与GES-1+MNNG组(MC细胞)相比,通过TGF-β 1激动剂干预后的MC细胞中TGF-β 1、Smad3、CTGF、Vimentin蛋白表达显著升高(P<0.05),而E-cadherin蛋白表达显著下降,具有统计学意义(P<0.05);与GES-1+MNNG+TGF-β 1激动剂组相比,TGF-β 1激动剂刺激后的MC细胞经高浓度健脾活血方干预后TGF-β 1、Smad3、CTGF、Vimentin蛋白表达显著下降(P<0.05),E-cadherin蛋白表达显著升高(P更多<0.05),具有统计学意义。结论:1.健脾活血方可以显著减轻脾虚血瘀型CAG癌前病变患者临床症状,改善患者胃镜下胃黏膜征象,逆转胃黏膜萎缩及肠上皮化生,对异型增生也有一定的抑制作用。2.全转录组测序显示PLGC细胞模型MC细胞经健脾活血方干预后差异mRNAs富集分析到的信号通路部分与CAG“炎-癌”转化密切相关,健脾活血方可能通过调节TGF-β1信号通路在本病中发挥治疗作用,为健脾活血方作用机制研究提供了方向。3.健脾活血方通过抑制TGF-β 1/Smad3/CTGF信号轴阻断MC细胞的EMT进程,阻止CAG“炎-癌”转化,这可能是其治疗CAG癌前病变的机制之一。