鲤科鱼类因其环境适应能力强、食用营养价值高等特点在水产养殖业中具有良好的经济价值,我国目前养殖的800种淡水鱼中,鲤科鱼类占50%以上。鲤春病毒血症(Spring viremia of carp,SVC)是一种造成鲤科鱼类急性死亡的病毒性疾病,因其具有发病急,死亡率高,传染性强的特点,且目前尚无有效的治疗药物,严重阻碍了鲤科鱼类养殖业的高质量发展,我国农业农村部将其列为II类动物疫病。自2003年我国首次从天津养殖场检测出鲤春病毒血症病毒(Spring viremia of carp virus,SVCV),每年都有鲤科鱼类感染SVCV的报道,给我国鲤鱼养殖业造成重大的经济损失,因此,加强对SVCV的监测、流行情况调查和致病机制研究具有重要意义。2022年在四川省乐山市送检的鲤鱼样本中分离得到一株鲤春病毒血症病毒,命名为SVCV-2022,全基因组测序和序列比对分析SVCV-2022与亚洲株亲缘关系近,与欧洲分支病毒株亲缘关系较远,病理学研究发现SVCV-2022感染对鲤鱼鳃、肠道的损伤最为明显,转录组学分析了鲤鱼感染SVCV后鳃、肠道的免疫应答特点。本研究为SVCV毒株的分子流行病学及遗传多样性,鲤鱼感染SVCV的免疫应答调控和病变特征提供实验依据。本论文的具体内容如下:1.一株鲤春病毒血症病毒的分离鉴定及全基因组分析2022年3月四川省乐山市某鲤鱼养殖场的鲤鱼突然出现急性死亡,死亡率累计80%以上,患病鱼表现为眼球突出、腹部膨大、全身性广泛性出血等。通过临床症状、病理学诊断、病毒分离鉴定与动物回归试验,明确导致乐山鲤鱼养殖场鲤鱼大规模死亡的病原为SVCV。通过EPC细胞分离得到一株SVCV,命名为SVCV-2022。对SVCV-2022进行全基因组序列测定,通过比对分析表明SVCV-2022(NCBI登录号:OP495631)全长11360bp,GC含量43.14%,共编码5种结构蛋白。基因组系统进化分析表明SVCV-2022同SH160901、SH150514、ADC-SVC2016-1在亚洲分支中形成了一个独特Antibiotic-associated diarrhea的新谱系,其中SVCV-2022与SH160901、SH150514病毒株序列相似性最高(96.1%),与欧洲分支病毒株亲缘关系较远且相似性最低(89.9%)。G基因、P基因系统进化结果显示SVCV-2022属于亚洲分支的Ia和Iai亚群型。SVCV-2022在P蛋白和G蛋白上出现了氨基酸突变,P基因分析表明SVCV-2022与已知分离株相比谷氨酸、缬氨酸、精氨酸分别突变成天冬氨酸、亮氨酸及赖氨酸(E46D、V139L、R308K);G基因编码的第219位赖氨酸突变为天冬酰胺(N219K),第352位的谷氨酸突变为天冬氨酸(E352D),第494位赖氨酸突变成精氨酸(K494R)。2.鲤春病毒血症病毒感染对鲤鱼鳃的损伤研究SVCV感染鲤鱼后,鳃主要病理特征为鳃小片弯曲、粘连和融合,鳃上皮细胞坏死、脱落,AB-PAS观察到鳃小片上大量III型黏液细胞增生;鳃组织的抗氧化酶SOD(P<0.05)、CAT(P<0.01)活性同对照组相比均显著降低,AKP活性下降(P>0.05NSC 125973研究购买),组织中Ig M、Ig T含量同对照组相比显著性增加(P<0.01)。鲤鱼感染SVCV 96h后利用RNA-seq测序分析发现得到了3288个差异表达基因,1435个基因下调和1853个基因上调。GO注释分析与KEGG富集分析结果显示,感染SVCV后鲤鱼鱼鳃组织出现了显著的免疫反应和代谢相关反应,差异表达基因参与NOD样受体信号通路、Toll样受体信号通路、C型凝集素受体信号通路、细胞坏死性凋亡及溶酶体等免疫相关信号通路。以上结果表明SVCV感染鲤鱼后鳃的呼吸功能、黏膜免疫结构及抗氧化系统受到损伤,导致其免疫功能的受损,从而引发鲤鱼免疫能力的下降。3.鲤春病毒血症病毒感染对鲤鱼肠道的损伤研究病理学观察发现SVCV感染后,肠道黏膜层充血、出血及炎性细胞浸润,肠黏膜上皮细胞变性、坏死、脱落,肠绒毛断裂,肠道酸性蛋白黏液层及Ⅱ型黏液细胞数量减少;与对照组相比,促炎因子IL-8(P<0.05)、IL-1β(P<0.01)基因相对表达量显著上调,抗氧化GPx4a基因表达量显著下调(P<0.01)。抗氧化酶活性降低,SOD、CAT活性与对照组相比明显下降,差异极显著(P<0.01),AKP显著下降(P<0.05)推测SVCV感染可能通过破坏肠道黏膜屏障,影响其抗氧化防御系统加剧肠道炎症的进程。SVCV感染96h后采集肠道利用RNA-seq测序分析,对照组和SVCV感染组差异表达基因达到5484个,包括2561个基因下调和2923个基因上调,GO注释分析发现差异表达基因主参与代谢过程、生物合成过程、蛋白酶体络合物、聚合的细胞骨架纤维、中间纤维细胞骨架、分子功能调节活性及绑定等,表明SVCV感染导致肠道黏膜屏障中的各细胞组成及相关结构功能的改变。KEGG分析显示差异表达基因主富集在NOD样受体信号通路、Toll样受体信号通路、RIG-I样受体信号通路、C型凝集素受体信号通路、细胞铁死亡等信号通路中。综上所述,导致乐山鲤鱼RepSox价格养殖场鲤鱼大规模死亡的病原为SVCV,此次分离的SVCV-2022属于Ia和Iai亚群,与中国上海SH160901、SH150514分离株亲缘关系最近;同亲缘关系较近的病毒分离株相比,SVCV-2022分离株在P蛋白和G蛋白上出现了明显的氨基酸替换。感染SVCV后,鲤鱼鳃的呼吸功能、黏膜免疫结构及抗氧化系统受到损伤,以导致其免疫功能的受损,从而引发鲤鱼免疫力下降;SVCV破坏肠道黏膜屏障,影响其抗氧化防御系统加剧肠道炎症的进程。转录组学研究发现感染SVCV后,鲤鱼鳃、肠道出现显著免疫及代谢相关反应,其中NOD样受体信号通路、Toll样受体信号通路、RIG-I样受体信号通路、C型凝集素受体信号通路、细胞坏死性凋亡、细胞铁死亡、溶酶体等相关信号通路与鲤鱼鳃、肠道感染SVCV后相关。