肺癌的发病人数和死亡人数均居全球癌症新发病例和死亡病例的前列。非小细胞肺癌(non-smspatial genetic structureall cell lung cancer,NSCLC)占肺癌的85%左右,其发病率高,起病隐匿,预后较差。目前NSCLC主要的临床治疗方法包括手术、放疗、化疗、靶向治疗和免疫治疗。然而,在大多数情况下,临床效果并不令人满意,手术和放化疗等治疗手段都具有各自的局限性,且药物耐药仍然是临床面临的一个主要难题。与这些疗法相比,中草药和天然产品通常副作用较小、适用性广泛,这使它们更适于癌症治疗。因此,深入探讨NSCLC的发生发展此网站机制,寻找低毒高效的治疗药物对肺癌的治疗是十分必要的。有研究表明,臭椿酮(ailanthone,AIL)是从植物臭椿中提取的传统中药成分,是一种低毒高效的治疗药物,可以抑制多种肿瘤细胞的生长,如白血病、肝癌、乳腺癌等。自噬是生物体内一种高度保守的受调节的分解代谢过程,自噬溶酶体能够降解损伤的胞质结构和入侵的病原体等,从而在人类健康和疾病中发挥重要作用。研究表明,自噬在癌症发生发展过程中具有抑制肿瘤生长的作用。铁死亡是一种区别于自噬的调节性细胞死亡方式,其特征是铁的积累、活性氧的累积、脂质过氧化物增加和抗氧化能力减低。已经发现,铁死亡可以抑制肺癌、乳腺癌等细胞的生长。目前,越来越多的证据表明,铁死亡的发生依赖于自噬的激活,且可以通过AMPK/mTOR/p70S6K通路来调控。本研究在NSCLC细胞系A549、HCC827细胞中检测了AIL对细胞的生长抑制作用;观察了各组细胞加药后引发的自噬和铁死亡现象;通过加入自噬/铁死亡抑制剂后进行挽救实验,证实了AIL通过自噬诱导铁死亡的发生,进而抑制NSCLC细胞的生长;另外,初步探讨了AIL抗肿瘤的潜在作用机制是否与调控AMPK/mTOR/p70S6K的自噬通路有关。本研究有希望为NSCLC的治疗提供新的方向,为AIL发挥抗肿瘤作用提供了理论依据。目的:旨在研究AIL是否通过自噬依赖性铁死亡抑制NSCLC细胞生长,并初步探讨AIL对AMPK/mTOR/p70S6K信号通路的影selleckchem Tezacaftor响。方法:1.MTT检测不同浓度(0、0.05、0.1、0.2、1、2、10、20、40μM)的AIL作用24 h后,人正常肺上皮细胞BEAS-2B细胞和5株NSCLC细胞(A549、HCC827、H1975、H226、H157细胞)的细胞活力,并找出AIL对细胞活力影响最大的两株细胞进行后续实验。2.MTT、克隆形成实验和Ed U实验检测不同浓度AIL(0、0.2、1、2μM)作用下,A549细胞和HCC827细胞的增殖能力变化。3.铁死亡检测试剂盒、蛋白印迹实验检测铁死亡相关蛋白表达,观察AIL是否诱发NSCLC细胞的铁死亡。4.各组细胞中加入AIL和铁死亡抑制剂(1μM Fer-1)后,应用铁死亡检测试剂盒、蛋白印迹实验检测铁死亡相关蛋白表达,通过回复实验观察AIL诱导NSCLC细胞的铁死亡作用。5.各组细胞中加入AIL和铁死亡抑制剂(1μM Fer-1)后,应用MTT、克隆形成实验和Ed U实验检测细胞增殖,通过挽救实验证实AIL通过铁死亡抑制NSCLC细胞的生长。6.免疫荧光和蛋白印迹实验检测自噬相关蛋白(p62、ATG5、Beclin1、LC3B)表达,观察AIL是否引起NSCLC细胞的自噬发生。7.各组细胞中加入AIL和自噬抑制剂(200 n M Baf-A1)后,应用铁死亡检测试剂盒、蛋白印迹实验检测铁死亡相关蛋白表达,通过挽救实验说明AIL能否引发NSCLC细胞的自噬依赖性铁死亡。8.各组细胞中加入AIL和自噬抑制剂(200 n M Baf-A1)后,应用MTT、克隆形成实验和Ed U实验检测细胞增殖,通过挽救实验证实AIL通过自噬依赖性铁死亡抑制NSCLC细胞的生长。9.不同浓度AIL(0、0.2、1、2μM)作用,或加入mTOR激活剂(2μM MHY1485)后,通过蛋白印迹实验检测AMPK/mTOR/p70S6K通路中关键蛋白及下游蛋白的表达情况,探究AIL对该通路的影响。结果:1.AIL作用正常肺上皮细胞BEAS-2B细胞24 h后,其IC_(50)值为(219.902±163.321)μM。AIL能够抑制5株NSCLC细胞(A549、HCC827、H1975、H226、H157细胞)的细胞活力,且随着药物浓度的增加,对NSCLC细胞活力的抑制作用逐渐增强,其中,AIL对A549细胞和HCC827细胞的抑制作用最明显(F=39.290,P<0.001),A549细胞的IC_(50)值为(1.026±0.203)μM,HCC827细胞的IC_(50)值为(0.625±0.338)μM。2.AIL能够明显抑制A549细胞和HCC827细胞的增殖能力和克隆形成能力,且具有浓度依赖性和时间依赖性。3.AIL能够诱导A549细胞和HCC827细胞发生铁死亡,并通过加入Fer-1后,验证AIL通过诱导铁死亡抑制NSCLC细胞生长。4.AIL能够促进A549细胞和HCC827细胞发生自噬,可观察到在免疫荧光实验中,LC3B的平均荧光强度逐渐增强、p62的平均荧光强度逐渐减低;在蛋白印迹实验中,p62蛋白表达减低,ATG5、Beclin1、LC3B蛋白表达逐渐增强。5.AIL通过自噬依赖性铁死亡抑制NSCLC细胞的生长:Baf-A1部分降低AIL对铁死亡促进作用,且Baf-A1部分挽救了AIL对NSCLC细胞的增殖抑制作用。6.不同浓度AIL调控了AMPK/mTOR/p70S6K通路,MHY1485部分回复了AIL对AMPK/mTOR/p70S6K通路及下游蛋白的表达。结论:1.AIL通过诱导自噬依赖性铁死亡,抑制NSCLC细胞的生长;2.AIL可能调控了自噬的经典信号通路AMPK/mTOR/p70S6K通路,并影响下游铁死亡蛋白的表达。