背景与目的妊娠滋养细胞肿瘤(gestational trophoblastic neoplasia,GTN)是一组起源于胎盘滋养细胞的恶性妇科肿瘤。化疗在治疗GTN方面有着举足轻重的地位,化疗方案的选择取决于FIGO评分判定的风险等级。低危和高危GTN患者分别采用单药或联合化疗,90%以上患者通过化疗即可获得痊愈。然而,部分患者对化疗产生耐药,发展成为难治性疾病。对于难治性GTN患者往往采取挽救性化疗为中心的综合治疗方案。组织学来源的特殊性使GTN具有较强的免疫原性,并且广泛高表达PD-L1。因此,PD-1抑制剂可作为难治性GTN患者新的治疗选择。在不同亚型的GTN肿瘤中,PD-1抑制剂显示出约50%的临床有效率,在实体肿瘤中居于前列,但仍有部分难治性GTN难以对PD-1抑制剂单药治疗产生有效反应,最终死于疾病进展。临床前研究表明,常规化疗可以通过多种机制增强内源性免疫反应。一方面,化疗药物可以通过增加肿瘤细胞免疫原性和增强T细胞的激活诱导机体适应性免疫。另一方面,化疗可能通过破坏肿瘤微环境中的免疫抑制成分来帮助恢复抗肿瘤免疫。大量临床研究证实了化疗的免疫调节作用,其中化疗与PD-1抑制剂联合应用在多种恶性肿瘤中表现出良好的抗肿瘤活性和可控的毒性。然而,在高危化疗耐药/复发GTN中,关于联合使用PD-1抑制剂和化疗的数据十分有限。因此,探究PD-1抑制剂联合化疗在难治性GTN患者中的疗效及安全性,了解化疗调节抗肿瘤免疫的具体机制,筛选预测PD-1抑制剂疗效的生物标志物以更精准地定位获益人群成为了当下亟需解决的问题。本研究包括以下三个部分:1.PD-1抑制剂联合化疗对比PD-1抑制剂单药治疗高危化疗耐药或复发性妊娠滋养细胞肿瘤的疗效及安全性分析;2.MTX通过花生四烯酸调节CD8+T细胞抗肿瘤功能的机制研究;3.基于空间转录组技术对妊娠滋养细胞肿瘤空间异质性的研究。材料与方法1.此项多中心回顾性队列研究收集了北京协和医院、中国医科大学附属盛京医院和复旦大学妇产科医院三所医院接受PD-1抑制剂或PD-1抑制剂联合化疗治疗的高危复发耐药或复发GTN患者资料。根据血清hCG水平每2个疗程评估疾病缓解情况。主要研究终点包含客观有效率、治疗持续时间、无进展生存期、总生存期和安全性。2.通过非靶向代谢组学筛选MTX处理的JEG-3细胞的差异代谢产物。应用肿瘤细胞-T细胞共培养系统研究MTX及其代谢产物花生四烯酸对CD8+T细胞的影响。证实花生四烯酸联合IFN-γ诱导JEG-3铁死亡的表型。3.收集4例GTN患者的肿瘤组织样本,根据其对PD-1抑制剂的不同治疗反应分为完全缓解(complete response,CR)组和疾病进展(progressive disease,PD)组。对样本进行空间转录组测序,分析GTN肿瘤异质性,评估不同细胞亚群的优势表达基因及其功能特点,并比较两组患者之间基因表达、免疫微环境及信号通路的差异。结果1.研究共纳入66例病例,其中35例患者接受PD-1抑制剂治疗,31例接受PD-1抑制剂联合化疗。联合治疗使客观有效率从PD-1抑制药组中的62.9%(22/35)显著提高到96.8%(30/31)(p<0.001)。PD-1抑制剂单药治疗和联合治疗队列中,完全缓解的中位治疗持续时间分别为2.2个月(IQR,1.4-4.2)和2.8个月(IQR,1.8-2.8),两组无显著差异(p=0.299)。PD-1抑制剂治疗失败患者后续挽救化疗的完全缓解率为84.6%(11/13),其中7例(63.6%)对既往失败的化疗方案再次产生有效反应。两组患者在OS方面没有显著差异(HR0.50,p=0.499),联合治疗组显著改善了 PFS(HR0.06,p<0.001)。最常见的3-4级不良反应是中性粒细胞减少(联合治疗组:25.8%,PD-1抑制剂单药组:11.4%,p=0.201)和丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)水平升高(联合治疗组:9.7%,PD-1抑制剂单药组:5.7%,p=Transmembrane Transporters抑制剂0.659)。两组中均未发生与使用治疗药物相关的死亡。2.体外细胞实验表明,低浓度的MTX在造成CD8+T细胞凋亡的同时增强了CD8+T细胞杀伤能力。非靶向代谢组学筛选出MTX处理后绒癌细胞上清中花生四烯酸含量显著上升。在肿瘤细胞-T细胞共培养系统中,花生四烯酸增加了CD8+T细胞FABP5的表达和脂肪酸摄取,并增强CD8+T细胞杀伤功能。FABP5抑制剂成功逆转了花生四烯酸诱导提高的CD8+T细胞的杀伤能力。花生四烯酸与PD-1单抗联合处理可以增加CD8+T细胞杀伤功能并促进IL-SV2A immunofluorescence2、IFN-γ、TNF-α的分泌。花生四烯酸协同IFN-γ可诱导显著降低铁死亡抑制分子GPX4的表达,同时升高铁死亡的特征标志MDA及脂质氧化水平。3.所有肿瘤组织被分为6个亚群,其中cluster5富含iCAF和apCAF,clusterl富含myCAF。Cluster2、3、4、6为富含肿瘤细胞亚群,表现出极强的空间异质性。CR组患者的CD8+Tem细胞及巨噬细胞评分更高,而PD组患者表现出更高的Treg浸润水平。与CR组患者相比,PD组患者肿瘤细胞HLA-G表达更高,p53和铁死亡通路显著下调。结论1.PD-1抑制剂联合化疗作为高危复发耐药GTN患者的补救治疗方案,较PD-1抑制剂单一疗法显著改善了患者预后,无显著增加的药物相关不良反应。PD-1抑制剂治疗失败患者可以重新获益于挽救性化疗。2.MTX可通过促进花生四烯酸分泌经FABEmpagliflozin试剂P5途径增强CD8+T细胞脂肪酸代谢,提高CD8+T细胞杀伤功能。花生四烯酸联合阻断PD-1可显著提高CD8+T细胞杀伤作用。同时CD8+T细胞分泌的IFN-γ可以协同花生四烯酸促进绒癌细胞铁死亡的发生。3.GTN肿瘤内异质性较大,肿瘤微环境中富含肿瘤相关成纤维细胞,其中iCAF和apCAF与GTN免疫抑制微环境有关,而myCAF可能与治疗结局相关。肿瘤免疫细胞类型及浸润水平、HLA-G的表达、p53及铁死亡通路可能有助于筛选PD-1抑制剂应答人群。