树舌灵芝(Ganoderma applanatumBiogenic Materials)是一种药用价值极高的大型真菌,在肿瘤、肝炎、肺炎、高血压、高血糖等多种严重疾病的治疗中有所应用。近年来,富硒食品因其具有抗癌、抗氧化等功能而成为保健食品研究领域的热门研究方向。许多品种的灵芝属真菌因具有较高的硒转化率,受到了广泛的关注和研究,而具有较高药用价值的树舌灵芝的富硒研究还未有报道。硒蛋白是灵芝等大型真菌中有机硒的主要存在形式,可以在人体中形成一系列的抗氧化酶,能够促进自身细胞新陈代谢和修复作用,还可以起到一定的预防免疫系统疾病、糖尿病、甲状腺疾病、心血管疾病、脑神经疾病以及生殖系统疾病的作用,如何有效利用硒蛋白在食品加工领域受到关注。超声波辅助碱提法是常用的从植物中提取蛋白的方法,但是由于大型真菌细胞壁结构坚实,超声时间过长,会影响硒蛋白提取的效率。酶法提取硒蛋白的方法较为温和,但可选择的酶大多价格昂贵。因此,开发高效率的硒蛋白提取工艺具有重要的现实意义。本研究通过筛选和诱Fer-1分子式变育种得到的一株富硒能力提高的树舌灵芝突变体YL108。以YL108为富硒载体,以获得硒蛋白为目标,筛选能够有效降解其细胞壁的破壁酶,发现黑曲霉来源的β-葡聚糖酶AnEglA6和哈茨木霉来源的几丁质酶ECH42对树舌灵芝的细胞壁有一定的降解作用。在此基础上对AnEglA6进行改造并对几丁质酶ECH42的表达方法进行优化,提高这两种酶与β-1,3-葡聚糖酶协同作用水解树舌灵芝细胞壁的能力。三种酶协同酶解后辅以短时超声破壁,可以有效提取树舌灵芝YL108的硒蛋白。论文主selleckchem Alisertib要研究内容如下:(1)在湖北利川县的废弃硒矿中筛选到的一株耐硒的树舌灵芝XQ20115,采用~(60)Co-γ射线诱变育种获得高耐硒树舌灵芝突变菌株YL108。YL108在硒浓度为90 mg·L~(-1)的培养基中生物量为11.9 g·L~(-1),菌体蛋白硒浓度937 mg·kg~(-1)。(2)为了提高AnEglA6对树舌灵芝细胞壁的降解能力,将AnEglA6的纤维素结合结构域(CBD),更换为能够降解不溶性纤维素的CBMs家族,其中更换为CBM9和CBM10家族来源的重组酶An Eg-CBM9和An Eg-CBM10表现出了较高的酶活且底物利用范围有了明显扩大,对树舌细胞壁的降解能力也得到明显提高;为了提高几丁质酶对树舌细胞壁的降解能力,构建了毕赤酵母的CRISPR/Cas9系统,敲除了液泡分选受体蛋白基因Vps10p-1、Vps10p-2,提高了几丁质酶ECH42在毕赤酵母的胞外分泌量,其中敲除了Vps10p-2后几丁质酶的表达量提高了50%。(3)建立了BGL6906+An Eg-CBM10+ECH42三酶协同水解树舌菌丝体,大幅度弱化细胞壁强度,超声时间5 min,树舌灵芝的蛋白提取率就达到了90%,进一步通过响应面实验优化超声波辅助酶法提取树舌硒蛋白工艺,最后蛋白提取率提高到94.8±0.5%。(4)通过HPLC-ICP-MS对多酶协同提取的富硒树舌蛋白中硒代胱氨酸、硒甲基胱氨酸和硒代蛋氨酸定量分析,分别为389 mg·kg~(-1)、2 mg·kg~(-1)和107 mg·kg~(-1),硒代蛋氨酸和硒代半胱氨酸是富硒树舌灵芝蛋白中硒代氨基酸主要存在形式。