背景胰腺癌是全球癌症死亡中常见原因,是消化道中最常见的癌症之一,素来有“癌症之王”的称号。欧洲、澳洲还有北美的一些地区是胰腺癌的高发地区,在过去的二三十年里,胰腺癌的发病率在急剧增加,可能导致增加的原因是全球人口的老龄化,但吸烟、过量饮酒、肥胖、高脂高蛋白饮食、过量食用咖啡、环境污染和遗传都是促使胰腺癌发生的主要原因,近些年的研究结果也表明糖尿病也是导致胰腺癌发生的重要原因之一。在临床的治疗过程中,主要的手段是化疗和手术治疗,但胰腺癌对于大多数化疗药物的治疗都不敏感,超过八成的患者术后状况不佳,更超过九成的患者治疗后存活率不足5年。胰腺癌具有高转移、高侵袭和高复发的特点,都是导致其超高死亡率的的原因。近些年来随着医学研究和医疗技术的高速发展,在胰腺癌的发现、诊断、治疗和预防都取得了部分进展,但尚未出现有效的治疗靶点和诊疗策略。因此,深入研究胰腺癌的发生机制,寻找特异性的表面标志物和更为有效的治疗靶点,进而进行更加精准的靶向治疗是至关重要的。硫化氢(Hydrogen sulfide,H_2S)是继一氧化碳(CO)和一氧化氮(NO)之后被发现的第三种信号分子,是一种具有臭鸡蛋气味并且可溶于水的气体。在之前的研Ferrostatin-1分子式究中一直都认为硫化氢是污染环境的有害气体,在最近几年的研究中,发现其在生理环境中有很多的作用,参与很多人体生理系统的调节,包括心血管系统、神经系统和呼吸系统等。同样,在肿瘤的研究过程中,发现肿瘤的发生发展与H_2S也有着密切的关联,但H_2S在肿瘤中的作用机制还存在一定的争议。在不同的肿瘤当中,H_2S对于肿瘤的发展有着不一样的作用,因此H_2S在肿瘤生物学中也有“双刃剑”之称。内源性H_2S的合成主要是依靠胱硫醚β-合成酶(CBS)、胱硫醚γ-裂解酶(CSE)和3-巯基丙酮酸硫转移酶(MPST)这三种关键酶。在不同的肿瘤中这三种酶的表达量也不尽相同,而且不同的酶对于肿瘤的影响也各不相同。在最近的研究中发现,H_2S的含量在很多的肿瘤细胞中显著增高,而且上述的三种酶是内源性H_2S合成的关键酶,因此我们从CBS、CSE和MPST这三个关键酶为出发点,探究在胰腺癌的发生发展过程中H_2S在其中发挥的作用和机制。目的研究胱硫醚β-合成酶(CBS)在人胰腺癌中的表达情况以及对人胰腺癌细胞PANC-1和MIA Pa Ca-2增殖、凋亡、迁移、侵袭和铁死亡的影响,并探究CBS在肿瘤细胞发展中的作用机制。方法1、通过硫化氢检测试剂盒、Western blot和q RT-PCR检测人胰腺癌细胞中硫化氢含量以及硫化氢三种关键合成酶的表达差异;确定CBS在人胰腺癌细胞中高表达后,通过慢病毒感染并使用适宜浓度的嘌呤霉素筛选,在荧光显微镜下观测感染效率,通过Western blot和q RT-PCR实验分别在蛋白水平和分子水平上验证CBS是否已经成功过表达或敲低。2、体外细胞功能实验,通过CCK8、MTT、Ed U染色、Tunel染色、软琼脂集落形成、划痕、平板克隆、Transwell和Invasion等实验对细胞的增殖能力、凋亡水平、克隆能力和迁移侵袭能力进行判定;Western blot检测CBS对细胞凋亡、铁死亡和EMT的相关蛋白,并检测相关信号通路的表达水平。3、通过体内实验,在裸鼠右前肢的腋下注射肿瘤细胞,探索CBS对肿瘤在体内生长的影响,并取肿瘤组织进行相关指标的免疫组化检测。4、通过CCK8、平板克隆、Transwell和Invasion实验检测敲低CBS对胰腺癌细胞紫杉醇敏感性的影响。5、通过预测、q PCR实验验证以及质粒的转染,探究CBS的上游调控因子。结果1、在胰腺癌细胞中,H_2S含量和CBS表达量均高于正常胰腺导管上皮细胞Western blot实验和q PCR实验检测发现与人正常胰腺导管上皮细胞相比,人胰腺癌细胞中的CBS呈现高表达水平,硫化氢含量检测也显示人胰腺癌细胞的硫化氢含量高于正常细胞。2、CBS促进人胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力(1)、MTT、CCK8实验和Ed U染色实验结果显示过表达CBS能够促进人胰腺癌细胞PANC-1和MIA Pa Ca-2的增殖,敲低CBS则抑制细胞的增殖。(2)、平板克隆和软琼脂实验结果显示,过表达CBS能够促进细胞的克隆能力,而敲低CBS则抑制细胞的克隆能力。(3)、划痕实验和Transwell实验结果显示过表达CBS增强细胞的迁移能力,而敲低CBS则抑制细胞的迁移能力。(4)、Invasion实验结果显示过表达CBS会增强细胞的侵袭能力,而敲低CBS则抑制细胞的侵袭能力。(5)、Western blot实验结果显示,过表达CBS后EMT相关蛋白中N-cadherin、Vimentin、MMP2和MMP9表达升高,而E-cadherin表示降低,敲低呈现与过表达相反的结果。3、CBS抑制人胰腺癌细胞发生凋亡和铁死亡(1)、Tunel染色实验结果显示过表达CBS抑制细胞发生凋亡,而敲低CBS则促进细胞发生凋亡。Western blot实验检测结果也与Tunel染色实验相对应,过表达CBS后凋亡相关蛋白中促凋亡蛋白Cyt C、Bax、Cleaved Caspase3、Cleaved Caspase9和Cleaved PARP表达降低,抗凋亡蛋白Bcl-2表达升高,敲低则呈现与过表达相反的结果。(2)、铁死亡相关指标试剂盒结果显示过表达CBS后细胞内Fe~(2+)和MDA含量降低,GSH/GSSG比值和GPX4含量升高,而敲低CBS后呈现相反结果。Western blot实验检测结果也与试剂盒结果相对应,过表达CBS后铁死亡相关蛋白中SLC7A11、GPX4、FTH-1、Glutaminase表达水平升高,Transferrin表达水平降低,敲低则呈现与过表达相反的结果。4、CBS通过Wnt/β-catenin促进人胰腺癌细胞的发生发展Western blot实验结果显示,过表达CBS后Wnt/β-catenin信号通路中Wnt3α和β-catenin表达水平以及GSK-3β的磷酸化水平都升高,敲低则呈现与过表达相反的结果。q PCR实验结果显示,过表达CBS后β-catenin下游相关的因子C-myc、MMP7和Cyclin D1的表达升高,敲低则呈现与过表达相反的结果。5、CBS促进裸鼠皮下荷瘤的生长在体内实验裸鼠皮Health care-associated infection下荷瘤模型中,过表达CBS后肿瘤体积、重量均大于对照组,而敲低结果与过表达结果相反。肿瘤组织切片染色结果显示,过表达CBS后Ki67、CD31、MMP9和GPX4阳性率均升高,Cleaved Caspase3阳性率降低,敲低CBS后得到相反结果。6、敲低CBS增强胰腺癌细胞的紫杉醇敏感性CCK8实验、平板克隆实验以及Transwell实验和Invasion实验结果显示,敲低CBS能够增强紫杉醇对胰腺癌细胞增殖和迁移侵袭的能力。7selleck NMR、mi R-1297是CBS的直接上游调控因子通过数据库筛选和q PCR实验的检测,发现mi R-1297在胰腺癌细胞中低表达,通过转染mi R-1297 mimic后CBS的表达明显降低;转染mi R-1297mimic和inhibitor后通过Western blot实验检测CBS的表达量,发现转染mimic后CBS表达量降低而转染inhibitor后CBS表达升高,确定了mi R-1297是CBS的上游调控因子,二者之间呈负相关。双荧光素酶实验结果显示,WT+NC组的荧光强度显著强于WT+mimic组,WT+NC组的荧光强度显著低于WT+inhibitor组,而转染突变质粒的各组之间荧光强度没有明显差异。结论内源性硫化氢合成酶CBS可以调控人胰腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭、凋亡和铁死亡,可能通过Wnt/β-catenin信号通路调节细胞的生长,进而影响人胰腺癌细胞的发生发展;敲低CBS能够增强胰腺癌细胞的紫杉醇敏感性。胰腺癌细胞PANC-1和MIA Pa Ca-2中mi R-1297是CBS的直接上游调控因子。